一种无毒C型肉毒梭菌基因工程亚单位疫苗及其生产方法技术

本发明专利技术涉及一种无毒C型肉毒梭菌基因工程亚单位疫苗及其生产方法，本发明专利技术制备的无毒性C型肉毒梭菌亚单位疫苗，系采用经过密码子优化、含有麦芽糖蛋白(MBP)标签的肉毒梭菌毒素(BoNTs)重链的无毒区域HC(BoHC)的重组蛋白(rMBP‑BoHC)生产，即最大限度地保证疫苗的安全性，又保持其有效性。同时，还疫苗的抗原能够以可溶的形式表达，因此具有制备工艺简单、免疫剂量低、免疫效力好等优点，是我国现行C型肉毒梭菌疫苗升级换代的理想候选疫苗。

A Genetically Engineered Subunit Vaccine of Clostridium Botulinum Type C and Its Production Method

【技术实现步骤摘要】
一种无毒C型肉毒梭菌基因工程亚单位疫苗及其生产方法
本专利技术涉及一种无毒C型肉毒梭菌基因工程亚单位疫苗及其生产方法。属于兽用生物制品领域。
技术介绍
肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)中毒是一种由肉毒梭菌毒素(ClostridiumbotulinumNeurotoxin，BoNTs)引起的非常严重的致死性疾病，不仅严重危害人类的健康，而且对畜牧业造成了重大的经济损失。目前，已知的肉毒梭菌共有A-G7个血清型。其中，对畜牧业危害最大的是C型肉毒梭菌。在许多国家和地区，包括巴西、欧洲和北美都有家畜肉毒杆菌中毒事件的报道，而且死亡率可高达99.92％及以上(GilLAF,CunhaC,MoreiraG,etal.ProductionandEvaluationofaRecombinantChimericVaccineagainstClostridiumbotulinumNeurotoxinTypesCandD[J].PLoSONE,2013,8(7):e69692.)，这不仅造成了巨大的经济损失，而且更是全球公共安全性问题。由于肉毒梭菌中毒具有发病急、病程短且死亡率极高的特点，一旦发病，往往还来不及治疗就因外毒素中毒而发生猝死，因此免疫接种是防控该病的有效方法。目前的商品化疫苗是由灭活的天然毒素(类毒素)与常规佐剂制备。该类疫苗在预防动物肉毒梭菌所致疾病方面虽然取得了一定的效果，但这种疫苗在使用过程中仍然暴露了一些缺陷，例如疫苗免疫易引起动物局部炎症及毒性反应；体外产生的毒素量不稳定，且在制备过程中涉及BoNTs(自然界已知最强的生物毒素HakamiRM,RuthelG,StahlAM,etal.Gainingground:assaysfortherapeuticsagainstbotulinumneurotoxin[J].TrendsinMicrobiology,2010,18(4):164-172)的灭活，存在毒素外泄或灭活不彻底等生物安全隐患。因此，开发安全性好、有效抗原含量高、免疫原性强的肉毒梭菌基因工程亚单位疫苗，是未来的发展方向。肉毒梭菌毒素(BoNTs)的前体毒素由单一多肽链构成，经自身的蛋白酶切割后活化，活化形式的毒素是由轻链(L)和重链(H)两条链组成。其中，轻链是一种金属依赖性蛋白酶，通过与重链的N末端(简称HN)连接，发挥酶活性。重链的C末端(简称BoHC)是毒素与神经元受体结合区域，同时也是一个很重要的拥有保护性抗原表位的无毒区域(RavichandranE,Al-SaleemFH,AncharskiDM,EliasMD,SinghAKetal.(2007)TrivalentvaccineagainstbotulinumtoxinserotypesA,B,andEthatcanbeadministeredbythemucosalroute.InfectImmun75:3043-3054)。已有的研究发现，在大肠杆菌或毕赤酵母中产生的重组BoHC能够诱导中和抗体的产生，并防止肉毒梭菌中毒(GilLAF,CunhaC,MoreiraG,etal.ProductionandEvaluationofaRecombinantChimericVaccineagainstClostridiumbotulinumNeurotoxinTypesCandD[J].PLoSONE,2013,8(7):e69692.)。然而，以上重组的HC通常以不溶性的包涵体形式存在，需要进行变性与复性处理。蛋白的变性与复性是一个极其复杂的过程，不同蛋白的复性条件各异，复性率往往很难提高，这是限制其应用的主要因素，而采用可溶性表达方式可很好的克服这一问题。为此，如何构建可溶性表达载体并且优化可溶性蛋白的高效表达方法，是本领域长期以来一直研究的热点课题。
技术实现思路
本专利技术目的在于制备出无毒C型肉毒梭菌基因工程亚单位疫苗，用于预防由C型肉毒梭菌感染引起的疾病。本专利技术技术方案1.一种无毒C型肉毒梭菌基因工程亚单位疫苗，其特征在于所述疫苗含有采用大肠杆菌作为宿主细胞并在细胞质中表达的重组肉毒梭菌毒素(rMBP-BoHC)；该重组毒素是由重组表达rMBP-BoHC的大肠杆菌(Escherichiacoli)的BL21(DE3)细胞作为生产菌株制备的，该菌株被命名为大肠埃希氏菌BL/BoM株，并已于2019年03月08日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCCNo.17317；所述疫苗用于预防由C型肉毒梭菌感染所致疾病。2.本专利技术所述一种无毒C型肉毒梭菌基因工程亚单位疫苗，其特征在于所述表达的rMBP-BoHC，该重组毒素与成熟的野生型肉毒梭菌毒素(BoNTs)相比，只含有重链的无毒区域，C-末端(简称BoHC)；所述rMBP-BoHC无毒力，大大降低了疫苗生产过程中的生物安全风险。3.本专利技术所述一种无毒C型肉毒梭菌基因工程亚单位疫苗，其特征在于所述疫苗中含有的rMBP-BoHC，是通过麦芽糖蛋白(MBP)作为添加助溶标签来实现BoHC的可溶性表达。4.本专利技术所述一种无毒C型肉毒梭菌基因工程亚单位疫苗，其特征在于所述表达的rMBP-BoHC，其编码的基因序列经过密码子优化，更易于在大肠杆菌中实现高表达和可溶表达。5.本专利技术所述一种无毒C型肉毒梭菌基因工程亚单位疫苗，其特征在于所述表达的rMBP-BoHC，含有便于蛋白纯化的标签，优选为C端含有6个组氨酸(6*His)标签。6.本专利技术所述一种无毒性C型肉毒梭菌基因工程亚单位疫苗，其特征在于其制备方法为：通过宿主细胞表达rMBP-BoHC，用所述表达rMBP-BoHC的埃希氏大肠菌BL/BoM株作为疫苗生产菌株，经发酵培养、诱导表达、菌体破碎、可溶性抗原蛋白分离纯化后，加双相油乳佐剂混合制成。7.本专利技术所述一种无毒C型肉毒梭菌基因工程亚单位疫苗，其特征在于用于表达rMBP-BoHC的“宿主细胞”，所述“宿主细胞”涵盖原核细胞和或真核细胞，可以是产抱子梭菌、产气荚膜梭菌、丙酮丁醇梭菌、蜡样芽胞杆菌、苏云金芽抱杆菌、曹状芽抱杆菌、嗜热溶蛋白芽胞杆菌、炭疽芽抱杆菌、巨大芽抱杆菌、枯草芽抱杆菌、大肠杆菌或酵母细胞；所述宿主细胞优选地是大肠杆菌宿主细胞，特别是大肠杆菌BL21(DE3)或Rosetta(DE3)。本专利技术有益效果本专利技术制备的无毒C型肉毒梭菌基因工程亚单位疫苗，系采用经过密码子优化、含有麦芽糖蛋白(MBP)标签的肉毒梭菌毒素(BoNTs)无毒区域HC(BoHC)的重组肉毒梭菌毒素(rMBP-BoHC)生产，即最大限度地保证疫苗的安全性，又保持其有效性。同时，还疫苗的抗原能够以可溶的形式表达，因此具有制备工艺简单、免疫剂量低、免疫效力好等优点，是我国现行C型肉毒梭菌疫苗升级换代的理想候选疫苗。1.首次将BoHC与麦芽糖蛋白(MBP)融合表达，实现了在大肠杆菌中的可溶性表达，获得了免疫原性优良的重组肉毒梭菌毒素rMBP-BoHC，从而避免了包涵体变性复性的繁琐工艺对抗原蛋白免疫原性的影响，减少了疫苗的制备时间和生产成本。2.首次将编码BoHC与助溶标签蛋白麦芽糖蛋白(MBP)融合蛋白的基因序列本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种无毒C型肉毒梭菌基因工程亚单位疫苗，其特征在于所述疫苗含有采用大肠杆菌作为宿主细胞并在细胞质中表达的重组肉毒梭菌毒素(rMBP‑BoHC)；该重组毒素是由重组表达rMBP‑BoHC的大肠杆菌(Escherichia coli)的BL21(DE3)细胞作为生产菌株制备的，该菌株被命名为大肠埃希氏菌BL/BoM株，并已于2019年03月08日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC No.17317；所述疫苗用于预防由C型肉毒梭菌感染所致疾病。

【技术特征摘要】
1.一种无毒C型肉毒梭菌基因工程亚单位疫苗，其特征在于所述疫苗含有采用大肠杆菌作为宿主细胞并在细胞质中表达的重组肉毒梭菌毒素(rMBP-BoHC)；该重组毒素是由重组表达rMBP-BoHC的大肠杆菌(Escherichiacoli)的BL21(DE3)细胞作为生产菌株制备的，该菌株被命名为大肠埃希氏菌BL/BoM株，并已于2019年03月08日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCCNo.17317；所述疫苗用于预防由C型肉毒梭菌感染所致疾病。2.如权利要求1所述一种无毒C型肉毒梭菌基因工程亚单位疫苗，其特征在于所述表达的rMBP-BoHC，该重组毒素与成熟的野生型肉毒梭菌毒素(BoNTs)相比，只含有重链的无毒区域，C-末端(简称BoHC)；所述rMBP-BoHC无毒力，大大降低了疫苗生产过程中的生物安全风险。3.如权利要求1所述一种无毒C型肉毒梭菌基因工程亚单位疫苗，其特征在于所述疫苗中含有的rMBP-BoHC，是通过麦芽糖蛋白(MBP)作为添加助溶标签来实现BoHC的可溶性表达。4.权利要求1所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈小云，薛麒，刘莹，李旭妮，杜吉革，李启红，朱真，张莹辉，印春生，姚文生，
申请(专利权)人：中国兽医药品监察所，
类型：发明
国别省市：北京,11