一种无毒性破伤风毒素和诺维梭菌α毒素重组融合蛋白制造技术

本发明专利技术涉及一种无毒性破伤风毒素和诺维梭菌α毒素重组融合蛋白。本发明专利技术制备的重组融合蛋白，系采用经过密码子优化、破伤风毒素C片段与诺维梭菌α毒素的C末端以及N端的无毒性抗原表位的重组融合蛋白生产，即最大限度地保留两种毒素蛋白的免疫原性，又避免了天然毒素的生物安全隐患。该重组融合蛋白可用来制备破伤风梭菌和诺维梭菌亚单位疫苗，与我国目前商品化的破伤风梭菌和诺维梭菌天然毒素灭活疫苗相比，具有制备工艺简单、免疫剂量低、疫苗效力优良等优点，并大大降低了疫苗生产过程中的生物安全风险，是上述两种梭菌毒素疫苗升级换代的理想候选疫苗抗原；而且在与其它抗原共同制备联苗时，无需增大联苗的使用剂量，即可制备联苗。

A recombinant fusion protein of nontoxic tetanus toxin and Clostridium norvegicum alpha toxin

【技术实现步骤摘要】
一种无毒性破伤风毒素和诺维梭菌α毒素重组融合蛋白
本专利技术涉及一种无毒性破伤风毒素和诺维梭菌α毒素重组融合蛋白。属于生物制品领域。
技术介绍
破伤风梭菌和诺维梭菌是能够引起人和多种动物发病的厌氧菌，对人类的健康和畜禽养殖业危害极大，而这两种梭菌的致病因素均是菌体分泌的外毒素。其中，破伤风梭菌只含有一种外毒素，被称为破伤风毒素(Tetanustoxin，TT)，而诺维梭菌主要能够产生α，β，γ，和δ共4种外毒素。根据上述毒素的产生情况，可将诺维梭菌分为A，B和C三种类型。其中，A和B型是引起牛羊发病的主要类型，而C型没有毒力(EeckhautV,BoyenF,PasmansF,etal.ClostridiumnovyitypeBasacausativeagentofbovinemeatspoilage[J].Anaerobe,2012,18(3):286-288.)。已有研究表明，诺维梭菌引起的牛和羊的坏死性肝炎(又称为黑疫)主要是与诺维梭菌产生的α毒素(Tncα)有关(AquinoPL,FonsecaFS,MozzerOD,etal.OptimizationoftheProductionofInactivatedClostridiumnovyiTypeBVaccineUsingComputationalIntelligenceTechniques[J].AppliedBiochemistry&Biotechnology,2016,179(5):895-909.)。由于破伤风梭菌病和诺维梭菌病发病急，往往来不及救治就死亡，导致死亡率较高。为此，疫苗免疫是预防以上两种疾病的有效手段，而商品化的梭菌疫苗主要是灭活疫苗。该类疫苗在预防动物破伤风梭菌病和诺维梭菌病方面虽然取得了一定的效果，但这些疫苗在使用过程中仍然暴露了一些缺陷，例如疫苗免疫易引起动物局部炎症及毒性反应；其在制备过程中涉及外毒素的灭活，存在外毒素外泄或灭活不彻底等生物安全隐患；此外，诺维梭菌毒素产量较低，且耗时过长，在发酵中的影响因素过多。因此，开发安全性好、有效抗原含量高、免疫原性强的重组破伤风毒素和重组诺维梭菌毒素，是未来的发展方向。目前，市场用量较大商品化梭菌灭活苗主要是羊快疫、猝疽、羔羊痢疾、肠毒血症三联四防灭活苗以及羊梭菌病多联干粉苗。其中，破伤风梭菌病主要是由破伤风毒素(TT)引起，羊黑疫(诺维梭菌病)主要与诺维梭菌分泌的α毒素(Tncα)有关(AquinoPL,FonsecaFS,MozzerOD,etal.OptimizationoftheProductionofInactivatedClostridiumnovyiTypeBVaccineUsingComputationalIntelligenceTechniques[J].AppliedBiochemistry&Biotechnology,2016,179(5):895-909.)。破伤风毒素(TT)，全长1315个氨基酸，相对分子质量约150kDa，由A、B和C共3个片段组成。其中，破伤风毒素C片段(TetanustoxinCfragment，TTc)相对分子质量50kDa，是毒素与细胞的结合区域。已有的研究发现，该区域在原核表达系统中不仅可溶表达的比例较高，且具有较好的免疫原性(WellsJM,WilsonPW,NortonPM,etal.Lactococcuslactis:high-levelexpressionoftetanustoxinfragmentCandprotectionagainstlethalchallenge[J].MolecularMicrobiology,2010,8(6):1155-1162.)。诺维梭菌α毒素(Tncα)是A型和B型诺维梭菌的主要致病因子，具有细胞毒性和致死性。Tncα由单链构成，蛋白分子量大约为250kDa，分为N末端和C末端。其中，N末端是该毒素的酶活性区域，而C末端是毒素与细胞受体的结合区，具有一定的抗原保护性(HofmannF,HerrmannA,HabermannE,etal.Sequencingandanalysisofthegeneencodingthealpha-toxinofClostridiumnovyiprovesitshomologytotoxinsAandBofClostridiumdifficile[J].MolGenGenet,1995,247(6):670-679.)。Schranner等人在Tncα的N端发现了数条抗原性良好且无毒力的抗原表位(SchrannerI,ErhardMH,KaltnerH,etal.Isolationofimmunogenicandlethalpeptidesofalpha-toxinfromClostridiumnovyitypeB[J].ToxiconOfficialJournaloftheInternationalSocietyonToxinology,1992,30(5-6):653.)，以上研究结果为无毒性重组诺维梭菌α毒素的研制提供了重要的理论基础。本专利技术制备的一种无毒性破伤风毒素和诺维梭菌α毒素重组融合蛋白，系采用宿主细胞表达经过密码子优化、含有破伤风毒素C片段(TetanustoxinCfragment，TTc)和诺维梭菌α毒素的N端3个无毒性抗原表位(第3位～第17位、第965位～第979位和第983位～第997位氨基酸)以及C末端(第1800位～第2178位氨基酸)重组融合基因而获得的。该重组融合蛋白以TTc为助溶签来实现Tncα的N端无毒性抗原表位和C末端融合蛋白的可溶性表达，一方面能够提高融合蛋白的抗原性，实现一种融合蛋白预防两种疾病的效果；另一方面，避免了包涵体变性复性的繁琐工艺对抗原蛋白免疫原性的影响，减少了目的蛋白的制备时间和生产成本。为此，该重组融合蛋白可作为我国现行破伤风梭菌和诺维梭菌的传统灭活疫苗升级换代的理想候选抗原。
技术实现思路
本专利技术目的在于利用构建的表达破伤风毒素C片段(TetanustoxinCfragment，TTc)和诺维梭菌α毒素的N端3个无毒性抗原表位(第3～第17位、第965～第979位和第983～第997位氨基酸)以及C末端(第1800～第2178位氨基酸)的重组融合蛋白的大肠杆菌制备出无毒性的重组融合蛋白(rTTc-Tcnαnc)，用于同时预防由破伤风梭菌以及诺维梭菌感染引起的疾病。本专利技术技术方案1.一种无毒性破伤风毒素和诺维梭菌α毒素重组融合蛋白，其特征在于所述rTTc-Tcnαnc与成熟的野生型破伤风毒素相比，只含有无毒的C片段；与成熟的野生型诺维梭菌α毒素相比，只含有无毒性的C端以及N端的无毒性抗原表位，优选的为以下3个抗原表位，分别为第3～第17位、第965～第979位和第983～第997位氨基酸；在融合蛋白的C端含有便于蛋白纯化的标签；所述rTTc-Tcnαnc是由重组表达rTTc-Tcnαnc的大肠杆菌(Escherichiacoli)的BL21(DE3)细胞作为生产菌株制备的，该菌株被命名为大肠埃希氏菌BL/TN株，并已于2019年01月11日送交北京市朝阳区北辰西路1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种无毒性破伤风毒素和诺维梭菌α毒素重组融合蛋白，其特征在于所述无毒性破伤风毒素和诺维梭菌α毒素重组融合蛋白(rTTc‑Tcnαnc)与成熟的野生型破伤风毒素相比，只含有无毒的C片段；与成熟的野生型诺维梭菌α毒素相比，只含有无毒性的C端以及N端的无毒性抗原表位，优选的为以下3个抗原表位：第3位～第17位、第965位～第979位和第983～第997位氨基酸；在融合蛋白的C端含有便于蛋白纯化的标签；所述重组融合蛋白是由重组表达rTTc‑Tcnαnc的宿主细胞大肠杆菌(Escherichia coli)的BL21(DE3)细胞作为生产菌株制备的，该菌株被命名为大肠埃希氏菌BL/TN株，并已于2019年01月11日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC No.17163。

【技术特征摘要】
1.一种无毒性破伤风毒素和诺维梭菌α毒素重组融合蛋白，其特征在于所述无毒性破伤风毒素和诺维梭菌α毒素重组融合蛋白(rTTc-Tcnαnc)与成熟的野生型破伤风毒素相比，只含有无毒的C片段；与成熟的野生型诺维梭菌α毒素相比，只含有无毒性的C端以及N端的无毒性抗原表位，优选的为以下3个抗原表位：第3位～第17位、第965位～第979位和第983～第997位氨基酸；在融合蛋白的C端含有便于蛋白纯化的标签；所述重组融合蛋白是由重组表达rTTc-Tcnαnc的宿主细胞大肠杆菌(Escherichiacoli)的BL21(DE3)细胞作为生产菌株制备的，该菌株被命名为大肠埃希氏菌BL/TN株，并已于2019年01月11日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCCNo.17163。2.如权利要求1所述一种无毒性破伤风毒素和诺维梭菌α毒素重组融合蛋白，其特征在该于所述rTTc-Tcnαnc是用生产菌株大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)BL/TB株经发酵培养、诱导表达、菌体破碎、可溶性抗原蛋白分离纯化后获得。3.如权利要求1所述一种无毒性破伤风毒素和诺维梭菌α毒素重组融合蛋白，其特征在于所述rTTc-Tcnαnc在所述宿主细胞的细胞质中表达。4.如...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜吉革，刘莹，张莹辉，陈小云，李旭妮，李启红，薛麒，朱真，王磊，印春生，姚文生，
申请(专利权)人：中国兽医药品监察所，
类型：发明
国别省市：北京,11