一种无毒性破伤风梭菌基因工程亚单位疫苗及其生产方法技术

本发明专利技术涉及一种无毒性破伤风梭菌基因工程亚单位疫苗及其生产方法，本发明专利技术制备的无毒性破伤风梭菌亚单位疫苗，系采用经过密码子优化的破伤风毒素C片段的重组毒素(rTTc)生产，即最大限度地保证疫苗的安全性，又保持其有效性。同时，还疫苗的抗原能够以可溶的形式表达，因此具有制备工艺简单、免疫剂量低、免疫效力好等优点，是我国现行破伤风梭菌疫苗升级换代的理想候选疫苗。

A Genetically Engineered Subunit Vaccine of Clostridium Tetanus and Its Production Method

【技术实现步骤摘要】
一种无毒性破伤风梭菌基因工程亚单位疫苗及其生产方法
本专利技术涉及一种无毒性破伤风梭菌基因工程亚单位疫苗及其生产方法，属于兽用生物制品领域。
技术介绍
破伤风梭菌(Clostridumtetani)是一种能够引起人和多种动物发病的厌氧菌，对人类的健康和畜禽养殖业危害极大，该菌的致病因素是菌体分泌的外毒素，破伤风毒素(Tetanustoxin，TT)。目前，使用的商品化破伤风梭菌疫苗主要是灭活疫苗，该类疫苗在预防动物破伤风梭菌所致疾病方面虽然取得了一定的效果，但该类疫苗在使用过程中仍然暴露了一些缺陷，例如疫苗免疫易引起动物局部炎症及毒性反应等；其在制备过程中涉及外毒素的灭活，存在毒素外泄或灭活不彻底等生物安全隐患；此外，培养上清中的各种微小毒素以及细菌的代谢产物往往成为免疫动物的致敏原，接种动物易产生不良反应，导致免疫效果下降甚至免疫失败。因此，开发安全性好、有效抗原含量高、免疫原性强的破伤风梭菌基因工程亚单位疫苗，是未来的发展方向。已有研究证实，破伤风毒素(TT)，全长1315个氨基酸，相对分子质量约150000，由A、B和C3个片段组成。其中，破伤风毒素C片段(TetanustoxinCfragment，TTc)是重链的C末端，相对分子质量50000，是毒素与细胞受体的结合区域。已经有的研究发现，该区域在原核表达系统中可溶表达的比例较高，具有较好的免疫原性(WellsJM,WilsonPW,NortonPM,etal.Lactococcuslactis:high-levelexpressionoftetanustoxinfragmentCandprotectionagainstlethalchallenge[J].MolecularMicrobiology,2010,8(6):1155-1162.)。
技术实现思路
本专利技术目的在于利用构建的重组表达破伤风毒素C片段(TetanustoxinCfragment，TTc)的大肠杆菌制备出一种无毒性破伤风梭菌基因工程亚单位疫苗，用于预防由破伤风梭菌感染引起的疾病。本专利技术技术方案1.一种无毒性破伤风梭菌基因工程亚单位疫苗，其特征在于所述疫苗含有采用大肠杆菌作为宿主细胞并在细胞质中表达的重组破伤风毒素C片段(rTTc)；该重组毒素是由重组表达rTTc的大肠杆菌(Escherichiacoli)的BL21(DE3)细胞作为生产菌株制备的，该菌株被命名为大肠埃希氏菌BL/MBo株，并已于2019年03月08日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCCNo.17320；所述疫苗用于预防由破伤风梭菌感染所致疾病。2.本专利技术所述一种无毒性破伤风梭菌基因工程亚单位疫苗，其特征在于所述疫苗含有的rTTc与成熟的野生型破伤风毒素(TT)相比，只含有无毒区域C片段(简称TTc)；所述rTTc无毒力，大大降低了疫苗生产过程中的生物安全风险。3.本专利技术所述一种无毒性破伤风梭菌基因工程亚单位疫苗，其特征在于所述疫苗中含有的rTTc的编码基因序列经过密码子优化，更易于在大肠杆菌中实现高表达和可溶表达。4.本专利技术所述一种无毒性破伤风梭菌基因工程亚单位疫苗，其特征在于所述疫苗含有的rTTc末端含有便于蛋白纯化的标签，优选为C端含有6个组氨酸(6*His)标签。5.本专利技术所述一种无毒性破伤风梭菌基因工程亚单位疫苗，其特征在于其制备方法为：通过宿主细胞表达rTTc，用所述表达rTTc的埃希氏大肠菌BL/MBo株作为疫苗生产菌株，经发酵培养、诱导表达、菌体破碎、可溶性抗原蛋白分离纯化后，加双相油乳佐剂混合制成；6.本专利技术所述一种无毒性破伤风梭菌基因工程亚单位疫苗，其特征在于用于表达rTTc的“宿主细胞”，所述“宿主细胞”涵盖原核细胞和或真核细胞，可以是产抱子梭菌、产气荚膜梭菌、丙酮丁醇梭菌、蜡样芽胞杆菌、苏云金芽抱杆菌、曹状芽抱杆菌、嗜热溶蛋白芽胞杆菌、炭疽芽抱杆菌、巨大芽抱杆菌、枯草芽抱杆菌、大肠杆菌或酵母细胞；所述宿主细胞优选地是大肠杆菌宿主细胞，特别是大肠杆菌BL21(DE3)或Rosetta(DE3)。本专利技术有益效果本专利技术涉及一种无毒性破伤风梭菌基因工程亚单位疫苗及其生产方法。本专利技术将破伤风毒素C片段(TTc)段进行重组表达，获得了对于动物体无毒的重组毒素，rTTc。本专利技术进一步公开了含有所述rTTc编码基因的重组表达载体和重组宿主细胞。本专利技术的rTTc在小鼠体内完全无毒，且在家兔模型中呈现良好的免疫原性和免疫保护性。本专利技术的rTTc或其编码基因能够应用于制备预防破伤风梭菌病的毒素亚单位疫苗或多价梭菌毒素亚单位疫苗。采用本专利技术提出的无毒性破伤风梭菌基因工程亚单位疫苗，与我国目前商品化的破伤风天然毒素灭活疫苗相比，大大降低了疫苗生产过程中的生物安全风险，生产方法稳定性好、耗时短，而且所制备的疫苗一免后的血清中和效价对破伤风梭菌毒素远远高于到目前商品化疫苗标准。此外，凭借疫苗半成品蛋白浓度高的优势，在与其它抗原共同制备联苗时，无需增大联苗的使用剂量，即可制备联苗，极大方便了联苗的开发。本专利技术涉及生物材料资源信息本专利技术涉及的微生物为：重组表达rTTc的大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)BL21(DE3)细胞株，该菌株被命名为大肠埃希氏菌BL/TT株，并已于2019年03月08日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCCNo.17320。附图说明图1为rTTc表达的SDS-PAGE鉴定结果图中M1:Proteinmarker；1:BSA(1μg)；2:BSA(2μg)；3:空载体细胞裂解物；4:15℃、16h诱导的细胞裂解物；5:37℃、4h诱导的细胞裂解物；6:空载体细胞裂解上清；7:15℃、16h诱导的细胞裂解上清；8:37℃、4h诱导的细胞裂解上清；9:空载体细胞裂解沉淀；10:15℃、16h诱导的细胞裂解沉淀；11:37℃、4h诱导的细胞裂解沉淀。图2为rTTc表达的Westernblot鉴定结果图中：M2:Westernblotmarker；1:空载体细胞裂解物；2:15℃、16h诱导的细胞裂解物；3:15℃、16h诱导的细胞裂解上清；4:15℃、16h诱导的细胞裂解物上清；5:37℃、4h诱导的细胞裂解上清；6:15℃、16h诱导的细胞裂解物沉淀；7:37℃、4h诱导的细胞裂解沉淀；图3为rTTc的纯化图中M1:Proteinmarker；1:37℃、4h诱导的细胞裂解液上清；2:流穿液；3:20mM咪唑洗脱液；4:50mM咪唑洗脱液5:500mM咪唑洗脱液；6：洗脱后的Ni柱。本专利技术具体实施方式1.本专利技术所述一种无毒性重组破伤风毒素(rTTc)，其中：(1)术语“TTc”意指破伤风毒素C片段，还涵盖一个或多个修饰(包括化学修饰和基因修饰)的破伤风梭毒素C片段。术语“基因修饰”意指缺失、置换或添加一个或多个氨基酸碱基。本专利技术的方法可以用来产生任何破伤风毒素C片段的同源物或其衍生物，包括例如破伤风毒素氨基酸序列SEQIDNo.1(GenBank编号：WP_115606337)的多肽及其衍生物。术语“衍生物”包含氨基酸突变如添加、置本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种无毒性破伤风梭菌基因工程亚单位疫苗，其特征在于所述疫苗含有采用大肠杆菌作为宿主细胞表达的重组破伤风梭菌毒素(rTTc)；该重组毒素是由重组表达rTTc的大肠杆菌(Escherichia coli)的BL21(DE3)细胞作为生产菌株制备的，该菌株被命名为大肠埃希氏菌BL/TT株，并已于2019年03月08日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC No.17320；所述疫苗用于预防由破伤风梭菌感染引起的疾病。

【技术特征摘要】
1.一种无毒性破伤风梭菌基因工程亚单位疫苗，其特征在于所述疫苗含有采用大肠杆菌作为宿主细胞表达的重组破伤风梭菌毒素(rTTc)；该重组毒素是由重组表达rTTc的大肠杆菌(Escherichiacoli)的BL21(DE3)细胞作为生产菌株制备的，该菌株被命名为大肠埃希氏菌BL/TT株，并已于2019年03月08日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCCNo.17320；所述疫苗用于预防由破伤风梭菌感染引起的疾病。2.权利要求1所述一种无毒性破伤风梭菌基因工程亚单位疫苗，其特征在于所述表达的rTTc，与野生型破伤风成熟毒素相比，只含有无毒的C片段；所述rTTc无毒力，大大降低了疫苗生产过程中的生物安全风险。3.权利要求1所述一种无毒性破伤风梭菌基因工程亚单位疫苗，其特征在于所述表达的rTTc，其编码的基因序列经过密码子优化，更易于在大肠杆菌中实现...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈小云，朱真，李旭妮，杜吉革，李启红，薛麒，刘莹，张莹辉，姚文生，印春生，
申请(专利权)人：中国兽医药品监察所，
类型：发明
国别省市：北京,11