一种碳量子点荧光免疫法快速检测丙烯酰胺的方法技术

本发明专利技术属于荧光法快速检测技术领域，具体一种碳量子点荧光免疫法快速检测丙烯酰胺的方法；具体步骤为：首先合成碳量子点，然后将功能化修饰适于生物标记的纳米材料碳量子点与丙烯酰胺特异性抗体结合，制备碳量子点标记丙烯酰胺抗体，得到高效的量子点‑抗体偶联复合物作为检测荧光探针，建立一种快速简便的荧光免疫分析方法应用在食品生产加工过程中丙烯酰胺的检测，为食品安全提供有效保障；本发明专利技术利用富含碳元素的前体物质柠檬酸合成碳量子点，来源广泛、成本低廉，安全环保；本发明专利技术提供的检测方法是基于酶联免疫法抗原抗体的特异性结合的原理检测丙烯酰胺，特异性较强，灵敏度较高，相比传统的酶联免疫法，检测时间缩短，检测效率提高。

A Rapid Detection Method of Acrylamide by Fluorescence Immunoassay with Carbon Quantum Dots

【技术实现步骤摘要】
一种碳量子点荧光免疫法快速检测丙烯酰胺的方法
本专利技术属于荧光法快速检测
，具体一种碳量子点荧光免疫法快速检测丙烯酰胺的方法。
技术介绍
丙烯酰胺是一种高水溶性的不饱和酰胺类小分子有害化合物，它广泛存在于常见的三大类加工食品中：高温加工的淀粉类食品(如薯片，最高含量至5312μg/L)、早餐谷类食品(如面包和面包卷，含量高至3436μg/L)、咖啡及其类似制品(如咖啡代用品，最高含量高至7300μg/L)。食品中丙烯酰胺产生的主要途径为美拉德反应的天冬酰胺途径及甘油三酯氧化反应的丙烯醛途径；其中美拉德反应的天冬酰胺途径受到各界广泛认可。它具有神经和生殖毒性，长期接触会导致细胞DNA的损伤；同时它有较强的组织渗透性，可以通过未破损的皮肤、粘膜、肺和消化道进入人体，经口摄入为吸收丙烯酰胺最快速和最完整的途径，并且无法通过代谢排出。丙烯酰胺的检测方法主要有色谱法、毛细管电泳法以及生物传感器法等。这些方法灵敏度虽然高，可同时分析多种样品、检出限低、具有良好的准确度和精密度，但对样本净化要求高，前处理操作复杂，检测成本较高、时间较长，限制了此方法在现场检测丙烯酰胺的应用。而随着量子点的快速发展，量子点越来越普遍的被用作新型荧光标记物用于生物检测中，因此开展有关量子点的应用研究工作具有十分重要的意义。这主要是由于量子点本身具有的独特的光学性质，较高荧光量子产率和稳定性；而碳量子点作为一种新型的荧光碳纳米材料，合成方法简单，保持了碳材料的无毒性、生物相容性好的优点，可与生物分子有效偶联后直接用于生物标记和检测，具有较好的安全性。目前，量子点作为新型荧光标记物被用于检测丙烯酰胺的报道并不多见。其中，有学者提出了一种基于丙烯酰胺聚合CdSe/Zns量子点改变其独特光物理性质的新型荧光传感检测丙烯酰胺的方法，将N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺与量子点结合来制备功能性量子点，然后将该功能性量子点与丙烯酰胺溶液混合，并在紫外灯照射下在光引发剂存在下发生聚合；与不存在丙烯酰胺相比，量子点之间的距离增加，导致荧光强度增加。但该方法灵敏度较低。相比以上检测方法，目前最常用的方法是基于抗原抗体特异性结合的标记免疫分析技术检测丙烯酰胺。这种方法特异性强，灵敏度高，便于推广。基于以上研究基础，为了提高检测灵敏度，缩短检测时间，因此可以利用功能化水溶性荧光碳量子点与生物抗体进行偶联标记，进行荧光免疫分析，实现对丙烯酰胺的快速高灵敏的检测。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术旨在解决所述技术问题之一，提供一种量子点标记抗体检测丙烯酰胺的方法，通过优化反应条件，实现丙烯酰胺特异性抗体与量子点的偶联，建立一种新的检测丙烯酰胺的技术。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：(1)碳量子点溶液的合成；首先，取柠檬酸和乙二胺溶解于水中，搅拌，得到混合溶液转移到水热反应釜中，然后置于干燥箱中加热反应，反应结束后得到粗制的碳量子点；然后加入氢氧化钠溶液和氯乙酸钠溶液，水浴超声反应，调节混合液的pH值至中性后，经透析、真空干燥浓缩后得到碳量子点溶液；(2)碳量子点标记丙烯酰胺抗体的制备；取步骤(1)中得到的碳量子点溶液加入到的碳酸氢钠缓冲液中，搅拌，加入戊二醛溶液，搅拌，再加入的丙烯酰胺特异性抗体溶液，得到混合溶液，转移至冰浴中反应；然后滴加硼氢化钠溶液，在冰浴条件下持续搅拌，然后于一定条件下静置后，再使用磷酸盐缓冲液缓冲液透析，得到碳量子点标记丙烯酰胺抗体溶液；(3)荧光免疫法快速检测丙烯酰胺；选用96孔黑色荧光酶标板，进行荧光酶联免疫分析实验：间接竞争荧光免疫检测步骤：S1：包被：取丙烯酰胺半抗原与鸡卵清蛋白混合反应，得到包被原溶液，然后用碳酸盐缓冲液将包被原溶液稀释至一定浓度，得到包被原溶液稀释液，然后加入96孔黑色荧光酶标板的孔中，4℃黑暗条件下静置；S2：洗板：将吐温20和磷酸盐缓冲液混合配置洗涤液，然后将洗涤液加入酶标仪全自动洗板机中，把S1中得到的96孔黑色荧光酶标板放在酶标仪全自动洗板机下重复洗板，洗板后将96孔黑色荧光酶标板孔中的溶液吸干；S3：封闭：将牛血清白蛋白溶解在磷酸盐缓冲液中配置溶液，得到封闭液，将封闭液加入到S2处理后的96孔黑色荧光酶标板孔中，于一定条件下进行静置，然后再次用酶标仪全自动洗板机进行洗板；S4：竞争：在经过S3处理后的96孔黑色荧光酶标板中的孔中加入丙烯酰胺半抗原溶液和步骤(2)得到的碳量子点标记丙烯酰胺抗体溶液，于一定条件下进行竞争反应，得到竞争溶液；在一定的激发波长和发射波长条件下，测定96孔黑色荧光酶标板各孔中竞争溶液的荧光强度；S5：绘制标准曲线：即分别以丙烯酰胺半抗原的的浓度为横坐标，以步骤S4得到的荧光强度的比值为纵坐标，建立荧光酶联免疫法检测丙烯酰胺的标准曲线；进而实现对待测样品中丙烯酰胺含量的检测。样品检测：选取待测样品，将样品进行研磨、加入甲醇提取，离心取上清液，离心条件为：4℃，8000-10000r/min，15-20min；加入石油醚充分振荡萃取油脂，去除下层液体；然后添加不同浓度的丙烯酰胺标准品，振荡混匀；再加入对巯基苯甲酸，调pH至9.6，40℃下避光反应1h合成丙烯酰胺半抗原，振荡混匀，进行S1-S5步骤得到吸光度值，通过S6计算出该吸光度值对应的丙烯酰胺半抗原浓度，计算丙烯酰胺浓度；其中样品、甲醇、丙烯酰胺标准品与对巯基苯甲酸的用量为5g：10-20mL：5mL：4mg。优选的，步骤(1)中所述用柠檬酸与乙二胺和水的用量比1mol：4mol：10mL。优选的，步骤(1)中所述加热温度为180-200℃，反应时间为3-5h；所述水浴超声反应的时间为3-4h。优选的，步骤(1)中所述用氢氧化钠溶液和氯乙酸钠溶液的溶液的浓度均为0.1g/mL。所述粗制的碳量子点溶液、氢氧化钠溶液和氯乙酸钠溶液的体积比为1:1:1。优选的，步骤(2)中所述碳量子点溶液的浓度为100-200mg/mL；所述碳酸氢钠缓冲液的浓度为500mM，pH＝9.5；所述用戊二醛溶液的质量浓度为5％；所述硼氢化钠溶液浓度为20mg/mL；所述丙烯酰胺特异性抗体溶液的浓度为1-4mg/mL。优选的，步骤(2)中所述碳量子点溶液、碳酸氢钠缓冲液、戊二醛溶液、丙烯酰胺特异性抗体溶液、硼氢化钠溶液的体积比为50-150：14-28:5-10：5-15:20-40。优选的，步骤(2)中所述一定条件为4℃黑暗条件；所述静置时间为10-12h；所述用磷酸盐缓冲液的浓度为10mM，pH＝7.4，透析时间为24-36h；所述的浓缩的方法为超滤浓缩管离心法，离心条件为4℃，8000-10000r/min，15-20min。优选的，步骤(3)的S1中所述的丙烯酰胺半抗原与鸡卵清蛋白用量的摩尔比为40～62:1。优选的，步骤(3)的S1中所述碳酸盐缓冲液的浓度为0.05mM，pH＝9.6；所述包被原溶液稀释至一定浓度为5-10mg/L；所述在96孔黑色荧光酶标板中每孔加入包被原溶液稀释液的用量为100-200uL；所述静置条件为4℃黑暗条件下静置10-12h。优选的，步骤(3)的S2中所述的吐温20与磷酸盐缓冲液的体积比为0.5-1：1000；所述洗涤液加入酶标仪全自动洗板机中的用量为300～500mL。优选的，步骤(3)的S3中本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种碳量子点荧光免疫法快速检测丙烯酰胺的方法，其特征在于，步骤如下：(1)合成碳量子点溶液；(2)取步骤(1)中得到的碳量子点溶液加入到的碳酸氢钠缓冲液中，搅拌，加入戊二醛溶液，搅拌，再加入的丙烯酰胺特异性抗体溶液，得到混合溶液，转移至冰浴中反应；然后加入硼氢化钠溶液，在冰浴条件下进行搅拌，然后于一定条件下静置后，再用磷酸盐缓冲液透析，得到碳量子点标记丙烯酰胺抗体溶液；(3)荧光免疫法检测丙烯酰胺；S1：取丙烯酰胺半抗原与鸡卵清蛋白混合反应，得到包被原溶液，然后用碳酸盐缓冲液将包被原溶液稀释至一定浓度，得到包被原溶液稀释液，然后加入96孔黑色荧光酶标板的孔中，静置；S2：将吐温20和磷酸盐缓冲液混合配置洗涤液，然后将洗涤液加入酶标仪全自动洗板机中，把S1中得到的96孔黑色荧光酶标板放在酶标仪全自动洗板机下重复洗板，洗板后将96孔黑色荧光酶标板孔中的溶液吸干；S3：将牛血清白蛋白溶解在磷酸盐缓冲液中配置溶液，得到封闭液，将封闭液加入到S2处理后的96孔黑色荧光酶标板孔中，于一定条件下进行静置，然后再次用酶标仪全自动洗板机进行洗板；S4：在经过S3处理后的96孔黑色荧光酶标板中的孔中加入丙烯酰胺半抗原溶液和步骤(2)得到的碳量子点标记丙烯酰胺抗体溶液，于一定条件下进行竞争反应，得到竞争溶液；在一定的激发波长和发射波长条件下，测定96孔黑色荧光酶标板各孔中竞争溶液的荧光强度；S5：分别以丙烯酰胺半抗原的的浓度为横坐标，以步骤S4得到的荧光强度的比值为纵坐标，建立荧光酶联免疫法检测丙烯酰胺的标准曲线；进而实现对待测样品中丙烯酰胺含量的检测。...

【技术特征摘要】
1.一种碳量子点荧光免疫法快速检测丙烯酰胺的方法，其特征在于，步骤如下：(1)合成碳量子点溶液；(2)取步骤(1)中得到的碳量子点溶液加入到的碳酸氢钠缓冲液中，搅拌，加入戊二醛溶液，搅拌，再加入的丙烯酰胺特异性抗体溶液，得到混合溶液，转移至冰浴中反应；然后加入硼氢化钠溶液，在冰浴条件下进行搅拌，然后于一定条件下静置后，再用磷酸盐缓冲液透析，得到碳量子点标记丙烯酰胺抗体溶液；(3)荧光免疫法检测丙烯酰胺；S1：取丙烯酰胺半抗原与鸡卵清蛋白混合反应，得到包被原溶液，然后用碳酸盐缓冲液将包被原溶液稀释至一定浓度，得到包被原溶液稀释液，然后加入96孔黑色荧光酶标板的孔中，静置；S2：将吐温20和磷酸盐缓冲液混合配置洗涤液，然后将洗涤液加入酶标仪全自动洗板机中，把S1中得到的96孔黑色荧光酶标板放在酶标仪全自动洗板机下重复洗板，洗板后将96孔黑色荧光酶标板孔中的溶液吸干；S3：将牛血清白蛋白溶解在磷酸盐缓冲液中配置溶液，得到封闭液，将封闭液加入到S2处理后的96孔黑色荧光酶标板孔中，于一定条件下进行静置，然后再次用酶标仪全自动洗板机进行洗板；S4：在经过S3处理后的96孔黑色荧光酶标板中的孔中加入丙烯酰胺半抗原溶液和步骤(2)得到的碳量子点标记丙烯酰胺抗体溶液，于一定条件下进行竞争反应，得到竞争溶液；在一定的激发波长和发射波长条件下，测定96孔黑色荧光酶标板各孔中竞争溶液的荧光强度；S5：分别以丙烯酰胺半抗原的的浓度为横坐标，以步骤S4得到的荧光强度的比值为纵坐标，建立荧光酶联免疫法检测丙烯酰胺的标准曲线；进而实现对待测样品中丙烯酰胺含量的检测。2.根据权利要求1所述的碳量子点荧光免疫法快速检测丙烯酰胺的方法，其特征在于，步骤(2)中所述碳量子点溶液的浓度为100-200mg/mL；所述碳酸氢钠缓冲液的浓度为500mM，pH＝9.5；所述用戊二醛溶液的质量浓度为5％；所述硼氢化钠溶液浓度为20mg/mL；所述丙烯酰胺特异性抗体溶液的浓度为1-4mg/mL。3.根据权利要求1所述的碳量子点荧光免疫法快速检测丙烯酰胺的方法，其特征在于，步骤(2)中所述碳量子点溶液、碳酸氢钠缓冲液、戊二醛溶液、丙烯酰胺特异性抗体溶液、硼氢化钠...

【专利技术属性】
技术研发人员：张灿，师晓漫，于欣欣，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32