一种用于快速检测脱氧雪腐镰刀菌烯醇的溶胶-凝胶免疫亲和色谱柱的制备方法技术

本发明专利技术属于免疫学检测技术领域，涉及一种用于快速检测脱氧雪腐镰刀菌烯醇的溶胶‑凝胶免疫亲和色谱柱的制备方法；步骤为：水解四甲氧基硅烷，制备得到抗DON抗体溶胶凝胶、兔抗HRP抗体溶胶凝胶和空白溶胶凝胶；然后取兔抗HRP抗体溶胶凝胶与空白溶胶凝胶混合后加入固相萃取小柱的筛板一上，去除磷酸盐缓冲液后盖上筛板二，构建控制层；将筛板三置于筛板二之上；取抗DON抗体溶胶凝胶与空白溶胶凝胶混合后加入固相萃取小柱的筛板三上，去除磷酸盐缓冲液后盖上筛板四，构建检测层，得到溶胶‑凝胶免疫亲和色谱柱；本发明专利技术不需要复杂的前处理和大型仪器的辅助，检测时间短、灵敏度和稳定性高，满足DON污染情况调查的可视化检测需求。

A preparation method of a sol gel immunoaffinity column for rapid detection of deoxynivalenol

【技术实现步骤摘要】
一种用于快速检测脱氧雪腐镰刀菌烯醇的溶胶-凝胶免疫亲和色谱柱的制备方法
本专利技术属于免疫学检测
，具体涉及一种用于快速检测脱氧雪腐镰刀菌烯醇的溶胶-凝胶免疫亲和色谱柱的制备方法。
技术介绍
脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)是镰刀菌属(Fusarium)的部分菌种(主要有Fusarium，Myrothecium和Stachybotrys)的一种次级代谢产物，主要污染谷物及其制品，人和动物食用污染DON的粮食和饲料后不仅可导致急慢性中毒，而且与很多疾病密切相关，因此有必要建立可靠、有效的检测方法对谷物中的DON污染进行现场监控。目前报导的DON检测方法主要有：薄层层析法(TLC)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、气相色谱法(GC)和高效液相色谱法(HPLC)等。薄层层析法这种检测方法具有简便、经济、对设备和检验人员要求不高等特点，但是检测的精确度低，操作过程复杂，分析结果的可重复性和再现性差；酶联免疫吸附试验具有快速、灵敏且操作简单的优点，但由于存在所用抗体与DON的乙酰化类似物的交叉反应致使其检出值偏高，较易出现假阳性；气相色谱法(和高效液相色谱法这些方法虽然能定量分析，但其操作繁琐、不能实现现场快速检测。所以，目前还没有建立可靠、有效的检测方法对谷物中的DON污染情况进行现场监控，实现谷物中DON残留现场快速筛选技术。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术旨在解决上述问题之一；本专利技术提供一种用于快速检测脱氧雪腐镰刀菌烯醇的溶胶-凝胶免疫亲和色谱柱的制备方法；结合了免疫亲和色谱法净化、富集及ELISA显色判定结果等特点的谷物中脱氧雪腐镰刀菌烯醇溶胶-凝胶(sol-gel)免疫亲和色谱柱显色快速检测方法；免疫亲和柱是在聚四氟乙烯空柱内设有两层，上层将封闭了抗DON抗体的溶胶凝胶(anti-DONsol-gel)装入构建检测层，待测样品中含有的DON可消除或减弱该层的颜色，从而根据颜色深浅达到检测样品中DON的目的；下层将兔抗辣根过氧化物酶抗体的溶胶凝胶(anti-HRPsol-gel)装入构建控制层，只要检测过程中加入酶标记物，该层都会显色；如果该层显色，则检测正常，如果该层无色，则检测失效，从而达到控制的目的。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案是：S1、将盐酸，蒸馏水和水解四甲氧基硅烷混合，在冰中声振，得到混合液A；S2、先将抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇抗体加入磷酸盐缓冲液中，再加入步骤S1的混合液A，振荡，混合液A凝胶化得到胶体，进行第一次称重，室温保存后再次称重，直至胶体重量为第一次重量的50％，然后将胶体进行研磨，研磨后经筛网筛选，装入固相萃取小柱中，使用乙腈–水溶液和磷酸盐缓冲液进行清洗，得到的抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇抗体溶胶凝胶，用磷酸盐缓冲液悬起，得到悬浮液B；S3、与步骤S2的操作相同，区别是使用兔抗辣根过氧化物酶抗体替代抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇抗体，得到兔抗辣根过氧化物酶抗体溶胶凝胶，用磷酸盐缓冲液悬起，得到悬浮液C；S4、将磷酸盐缓冲液加入步骤S1的混合液A，振荡，混合液A凝胶化得到胶体，进行第一次称重，室温保存后再次称重，直至胶体重量为第一次重量的50％，然后将胶体进行研磨，研磨后经筛网筛选，装入固相萃取小柱中，使用乙腈–水溶液和磷酸盐缓冲液进行清洗，得到空白溶胶凝胶，用磷酸盐缓冲液悬起，得到悬浮液D；S5、首先取固相萃取小柱，然后将筛板一放入固相萃取小柱中；将步骤S3制备的悬浮液C与步骤S4制备的悬浮液D按一定比例混合，加入固相萃取小柱的筛板一上，去除磷酸盐缓冲液后盖上筛板二，筛板一与筛板二之间的区域为控制层；再取筛板三置于筛板二之上，两者之间留有一定距离；然后，将步骤S2制备的悬浮液B与步骤S4制备的悬浮液D按一定比例混合，加入固相萃取小柱的筛板三上，去除磷酸盐缓冲液后盖上筛板四，筛板三与筛板四之间的区域为检测层，得到溶胶-凝胶免疫亲和色谱柱。优选的，步骤S1中所述盐酸的浓度为0.04M；所述盐酸、蒸馏水和四甲氧基硅烷的体积比为0.1-0.3：0.5-1：3-4。优选的，步骤S1中所述在冰中声振的时间为20-30min。优选的，步骤S2中所述anti-DON抗体、磷酸盐缓冲液和混合液的用量比为2-4mg：2-4mL：2-4mL；所述乙腈–水溶液中乙腈和水的体积比为2:3。优选的，步骤S2中所述筛网的目数为200目。优选的，步骤S3中所述兔抗辣根过氧化物酶抗体、磷酸盐缓冲液和混合液A的用量比为2-4mg：2-4mL：2-4mL。优选的，步骤S4中所述磷酸盐缓冲液和混合液A的体积比为1：1。优选的，步骤S5中所述悬浮液C与悬浮液D的体积比为1:70-80；所述悬浮液B与悬浮液D的体积比为1:100。优选的，步骤S5中所述悬浮液C与悬浮液D混合后加入固相萃取小柱的筛板一上的总体积为200～300μL；所述悬浮液B与悬浮液D混合后加入固相萃取小柱的筛板三上的总体积为200～300μL。优选的，步骤S5中所述筛板三与筛板二之间的距离为1～3mm。溶胶-凝胶免疫亲和色谱柱显色快速检测谷物中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇，具体步骤如下(1)待测样本提取液：谷物样品预先研磨粉碎，取2g置于离心管中，加入10mL20％甲醇溶液，涡旋混合提取3-5min后，4℃条件下以5000×g离心15-20min，取上清液；(2)免疫亲和色谱柱检测法：将DON-HRP(酶标抗原)加入1.0mL步骤(1)的待测样本提取液中并混匀；将提取液由进口加入免疫亲和色谱柱，并使用注射器控制，使上样时间在3min；加入3.0mLPBST(0.01mol/L,0.01％吐温20)和3.0mLPBS各洗涤1次，使用注射器挤干；将显色底物200μL由出口加入免疫亲和色谱柱，保证显色底物完全浸润控制层和检测层；反应5-10min后对结果进行判定：检测层和控制层同时显蓝色，则判定待测样本为阴性；检测层无色而控制层为蓝色，则判定待测样本为阳性；若二者均不显色，则判定结果无效。本专利技术的有益效果：(1)本专利技术使用sol-gel作为填料制备色谱柱进行柱显色，使用的sol-gel材料具有透光性，可视化特性，比传统的琼脂糖凝胶好；同时材料坚硬，廉价易制备。(2)本专利技术使用TMOS制备的sol-gel填料由二氧化硅分子形成的网状结构构成，抗体被封闭在二氧化硅形成的空腔内，可以自由运动，克服了使用琼脂糖载体固相偶联产生的抗体非定向偶联及空间位阻的缺点，提高了柱容量和免疫亲和色谱柱检测法的灵敏度。(3)本专利技术使用琼脂糖填料的免疫亲和色谱柱对保存条件要求较高，需要在缓冲液中添加防腐剂4℃保存，而二氧化硅网状结构的孔隙很小，可以保证待测物质与抗体反应的同时微生物及较大杂质不能进入二氧化硅空腔，因此ICTC柱保存条件简单，4℃密封保存即可，不需要缓冲液和防腐措施。(4)本专利技术中填料的基质是二氧化硅，机械强度远高于琼脂糖填料，对前处理过程操作要求低，能更好地适应复杂现场检测环境的需要。(5)本专利技术所公开的免疫亲和柱显色分析方法不需要复杂的前处理和大型仪器的辅助，检测时间短，其灵敏度和稳定性可满足谷物中DON污染情况调查的可视化检测需求。附图说明图1是免疫亲和检测柱的装配图。图2是免疫亲和检测柱的检测流程图。其中，1-筛板一，2-筛板二，3-筛板三，4-筛板四，5-控制层本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于快速检测脱氧雪腐镰刀菌烯醇的溶胶‑凝胶免疫亲和色谱柱的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、将盐酸，蒸馏水和水解四甲氧基硅烷混合，在冰中声振，得到混合液A；S2、先将抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇抗体加入磷酸盐缓冲液中，再加入步骤S1的混合液A，振荡，混合液A凝胶化得到胶体，进行第一次称重，室温保存后再次称重，直至胶体重量为第一次重量的50％，然后将胶体进行研磨，研磨后经筛网筛选，装入固相萃取小柱中，使用乙腈–水溶液和磷酸盐缓冲液进行清洗，得到的抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇抗体溶胶凝胶，用磷酸盐缓冲液悬起，得到悬浮液B；S3、与步骤S2的操作相同，区别是使用兔抗辣根过氧化物酶抗体替代抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇抗体，得到兔抗辣根过氧化物酶抗体溶胶凝胶，用磷酸盐缓冲液悬起，得到悬浮液C；S4、将磷酸盐缓冲液加入步骤S1的混合液A，振荡，混合液A凝胶化得到胶体，进行第一次称重，室温保存后再次称重，直至胶体重量为第一次重量的50％，然后将胶体进行研磨，研磨后经筛网筛选，装入固相萃取小柱中，使用乙腈–水溶液和磷酸盐缓冲液进行清洗，得到空白溶胶凝胶，用磷酸盐缓冲液悬起，得到悬浮液D；S5、首先取固相萃取小柱，然后将筛板一(1)放入固相萃取小柱中；将步骤S3制备的悬浮液C与步骤S4制备的悬浮液D按一定比例混合，加入固相萃取小柱的筛板一(1)上，去除磷酸盐缓冲液后盖上筛板二(2)，筛板一(1)与筛板二(2)之间的区域为控制层(5)；再取筛板三(3)置于筛板二(2)之上，两者之间留有一定距离；然后，将步骤S2制备的悬浮液B与步骤S4制备的悬浮液D按一定比例混合，加入固相萃取小柱的筛板三(3)上，去除磷酸盐缓冲液后盖上筛板四(4)，筛板三(3)与筛板四(4)之间的区域为检测层(6)，得到溶胶‑凝胶免疫亲和色谱柱。...

【技术特征摘要】
1.一种用于快速检测脱氧雪腐镰刀菌烯醇的溶胶-凝胶免疫亲和色谱柱的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、将盐酸，蒸馏水和水解四甲氧基硅烷混合，在冰中声振，得到混合液A；S2、先将抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇抗体加入磷酸盐缓冲液中，再加入步骤S1的混合液A，振荡，混合液A凝胶化得到胶体，进行第一次称重，室温保存后再次称重，直至胶体重量为第一次重量的50％，然后将胶体进行研磨，研磨后经筛网筛选，装入固相萃取小柱中，使用乙腈–水溶液和磷酸盐缓冲液进行清洗，得到的抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇抗体溶胶凝胶，用磷酸盐缓冲液悬起，得到悬浮液B；S3、与步骤S2的操作相同，区别是使用兔抗辣根过氧化物酶抗体替代抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇抗体，得到兔抗辣根过氧化物酶抗体溶胶凝胶，用磷酸盐缓冲液悬起，得到悬浮液C；S4、将磷酸盐缓冲液加入步骤S1的混合液A，振荡，混合液A凝胶化得到胶体，进行第一次称重，室温保存后再次称重，直至胶体重量为第一次重量的50％，然后将胶体进行研磨，研磨后经筛网筛选，装入固相萃取小柱中，使用乙腈–水溶液和磷酸盐缓冲液进行清洗，得到空白溶胶凝胶，用磷酸盐缓冲液悬起，得到悬浮液D；S5、首先取固相萃取小柱，然后将筛板一(1)放入固相萃取小柱中；将步骤S3制备的悬浮液C与步骤S4制备的悬浮液D按一定比例混合，加入固相萃取小柱的筛板一(1)上，去除磷酸盐缓冲液后盖上筛板二(2)，筛板一(1)与筛板二(2)之间的区域为控制层(5)；再取筛板三(3)置于筛板二(2)之上，两者之间留有一定距离；然后，将步骤S2制备的悬浮液B与步骤S4制备的悬浮液D按一定比例混合，加入固相萃取小柱的筛板三(3)上，去除磷酸盐缓冲液后盖上筛板四(4)，筛板三(3)与筛板四(4)之间的区域为检测层(6)，得到溶胶-凝胶免疫亲和色谱柱。2.根据权利要求1所述的用于快速检测脱氧雪腐镰刀菌烯醇的溶胶-凝胶免疫亲和色谱柱的制备方法，其特征在于，步骤S1中所述盐酸的浓度为0.04M；所述盐...

【专利技术属性】
技术研发人员：孟辉，黄珊，张祯，曾昆，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32