本发明专利技术涉及一株重组A型口蹄疫病毒VP1基因的粗糙型布鲁氏菌的构建及其疫苗生产方法。本发明专利技术以粗糙型牛种布鲁氏菌弱毒株RA343株为亲本株，以蔗糖自杀质粒为载体，将含有特定启动子序列的A型口蹄疫病毒VP1基因经密码子优化后无痕插入到了布鲁氏菌基因组中，成功构建了能够高效表达型FMDV VP1基因的重组布鲁氏菌RA343‑VP1‑FMDV‑A株。该重组疫苗株不仅保留了原始亲本株RA343的粗糙型特性，对布鲁氏菌病(布病)良好的免疫保护性，而且该重组菌免疫动物后，能产生针对FMDV VP1抗体，从而实现对FMD的免疫保护。该重组疫苗株按特定工艺开发成具有耐热保护特点的新型疫苗，免疫动物后能同时实现对布病和口蹄疫的双重免疫保护。
A Rough Brucella Strain Recombinant VP1 Gene of Foot and Mouth Disease Virus Type A and Its Vaccine Production Method
【技术实现步骤摘要】
一株重组A型口蹄疫病毒VP1基因的粗糙型布鲁氏菌及其疫苗生产方法所属
本专利技术涉及一株重组A型口蹄疫病毒VP1基因的粗糙型布鲁氏菌及其疫苗生产方法，属于兽用生物制品领域。技术背景布鲁氏菌病(布病)是由布鲁氏菌或称布鲁氏菌(Brucella)引起的以流产和发热为特征的人兽共患病，严重地威胁着人和多种动物的生命健康。本病不但对动物的繁殖和生产性能具有严重危害，更重要的是，人感染布鲁氏菌后，往往难以治愈，从而造成严重的公共卫生问题。因此在布鲁氏菌流行的国家，消除布病一直是公共卫生计划中最重要的目标之一。目前全世界范围内消除该病的主要方法是扑杀与免疫相结合，对布病发生相对比较严重的中国，由于扑杀的成本高，疫苗预防成为本病主要控制手段。2007—2012年间，本实验室陆续从我国不同省份和地区牛、羊、犬和鹿等动物体内分离到牛种布鲁氏菌41株，羊种布鲁氏菌74株，犬种布鲁氏菌9株。研究过程中，我们初步发现了一株牛种布鲁氏菌分离株，其毒力介于强毒和疫苗毒之间，专利申请人已对其进行了全面的生化检定，并分别用小鼠和豚鼠测定了其毒力。结果发现其毒力介于强毒和弱毒之间，测定为中等毒力布鲁氏菌，命名为Abortus343。本专利技术对此分离株进行了诱导和驯化，筛选获得了稳定的粗糙型布鲁氏菌疫苗株，命名为RA343，并已取得相关专利(ZL201410240895.6)。目前该疫苗株已经完成了全部的实验室研发和临床试验，进入新兽药注册环节。口蹄疫(Footandmouthdisease,FMD)是由口蹄疫病毒(Footandmouthdiseasevirus,FMDV)引起的牛、羊等的一种急性、热性、高度接触性传染病。2013年春季以来，我国多地发生牛A型口蹄疫疫情，与2009年暴发的A型口蹄疫相比较，主要表现以下特点：一是未实施免疫接种的牛群症状表现比较典型，感染传播速度较快，感染率高达80％。近年来我国新疆等地相继出现A型口蹄疫疫情，造成了巨大的经济损失。VP1蛋白是FMDV的主要结构蛋白，也是病毒感染细胞的关键，具有与细胞受体结合的位点，所以VP1基因是研制基因工程疫苗的首选靶抗原。
技术实现思路
本专利技术的目的以粗糙型牛种布鲁氏菌弱毒株RA343株为亲本株，利用蔗糖自杀质粒为载体，将含有特定启动子序列的A型FMDVVP1基因经密码子优化后无痕插入到了布鲁氏菌基因组中，成功构建了能够高效表达型FMDVVP1基因的重组布鲁氏菌RA343-VP1-FMDV-A株。该重组疫苗株不仅保留了原始亲本株RA343的粗糙型特性，对布鲁氏菌病(布病)良好的免疫保护性，而且该重组菌免疫动物后，能产生针对FMDVVP1抗体，从而实现对FMD的免疫保护。该重组疫苗株按特定工艺开发成具有耐热保护特点的新型疫苗，免疫动物后能同时实现对布病和口蹄疫的双重免疫保护。本专利技术的技术方案：1.一株重组A型口蹄疫病毒VP1基因的布鲁氏菌疫苗，其特征在于该疫苗免疫动物后能同时实现对布病和A型口蹄疫的双重免疫保护，其生产菌株是一株含有能够高效表达A型口蹄疫病毒VP1基因的的重组粗糙型布鲁氏菌RA343-VP1-FMDV-A株(简称布鲁氏菌RA343-VP1-FMDV-A株)，该菌株是通过将P3启动子与VP1序列进行密码子优化，人工合成基因片段，并构建含有P3-VP1(FMDV-A)序列及布鲁氏菌上下游同源臂的蔗糖自杀质粒载体pUC/P3-VP1+，将A型口蹄疫病毒VP1基因表达框部分无痕插入到布鲁氏菌基因组中，通过氨苄蔗糖双筛选筛选出阳性克隆，并进行传代培养，通过PCR及测序鉴定其稳定性，获得牛种布鲁氏菌(Bovinebrucella)重组布鲁氏菌RA343-VP1-FMDV-A株。并于2019年03月14日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCCNo.17332。2.本专利技术所述的一种重组粗糙型布鲁氏菌疫苗，其特征在于其其生产用重组布鲁氏菌RA343-VP1-FMDV-A株菌区别于其他细菌的特异性是采用一对特异性PCR引物(序列21和序列22)扩增出大小为778bp的特异性片段(序列23)；该重组布鲁氏菌VP1(FMDV-A)基因的表达验证是通过实时荧光定量PCR(qPCR)的方式验证VP1(FMDV-A)基因转录水平的表达；通过蛋白印记法(WesternBlot)验证VP1(FMDV-A)基因在蛋白水平的表达；将重组菌免疫小鼠，监测小鼠体内VP1(FMDV-A)抗体的表达情况。3.本专利技术所述的一种重组粗糙型布鲁氏菌疫苗，其特征在于该疫苗的生产方法是用胰蛋白胨大豆肉汤作为布鲁氏菌CGMCCNo.17332株的培养基；培养基灭菌后按培养基量的1％～2％接入布鲁氏菌CGMCCNo17332株种子菌液，37℃，按常规方法发酵培养28～38h，加入兽用生物制品冻干保护剂，充分混匀、分装疫苗瓶中后经冷冻真空干燥，即成为粗糙型RA343-VP1-FMDV-A株布鲁氏菌病疫苗。4.本专利技术所述的一种重组布鲁氏菌活疫苗，其特征在于该疫苗其中的冻干保护剂，其配方为：PVP5～15g，BSA5～15g，海藻糖50～100g，甘露醇50g，硫脲10～15g，抗坏血酸2g，维生素C2g，199培养2g，磷酸氢二钾1.25g，磷酸二氢钾0.52g，溶于注射用水1000ml中。5.本专利技术所述的一种重组粗糙型布鲁氏菌疫苗，其特征在于该疫苗免疫效果是通过将疫苗免疫绵羊后，分别采用布鲁氏菌及A型口蹄疫病毒进行攻毒保护试验进行评价。本专利技术的有益效果1.布鲁氏菌病和口蹄疫是严重危害我国牛羊养殖业的两大疫病。本专利技术用布鲁氏菌疫苗RA343为载体，构建了能成功表达了A型FMDVVP1基因的新型疫苗株，巧妙解决了我国当前牛群中两种重要疾病(布鲁氏菌病和A型口蹄疫)的防控难题，实现了“一针防两病”的构想，减少了生产实践中的免疫成本和劳动力成本；2.目前就全球范围内，困扰布病免疫防控的关键技术难题是疫苗免疫产生的抗体(光滑型抗体)干扰了布病的临床诊断。而本专利技术巧妙采用粗糙型布鲁氏菌(RA343株)作为载体，疫苗免疫动物后产生的是粗糙型抗体，不干扰布病的临床诊断，从根本上改进了现有布病疫苗的弱点；3.本专利技术弥补了A型口蹄疫疫苗缺少细胞免疫的不足，提高了免疫保护效果。考虑到口蹄疫弱毒疫苗毒力返强的风险，目前全球均使用灭活疫苗预防A型口蹄疫，要想取得较好的免疫效果，往往需要使用高浓度的病毒抗原，从而加大动物机体的免疫负荷，过多消耗免疫潜能。即便如此，基于以体液免疫为主的A型口蹄疫灭活疫苗也常常出现免疫失败的现象。本专利技术采用布鲁氏菌RA343活疫苗株作为载体，在诱导产生针对A型口蹄疫病毒VP1抗体的同时，也有效诱导宿主产生强烈的细胞免疫反应，从而实现了对A型口蹄疫良好的免疫保护；4.本专利技术从根本上缩短了常规口蹄疫疫苗的生产周期，大幅降度生产成本。将经典的病毒培养转化为细菌发酵，使A型口蹄疫疫苗的生产成本发生本质降低。以前为了尽量提高A型口蹄疫疫苗的免疫保护效果，往往需要培养大量病毒，并进行高度浓缩，从而获得足够浓度的抗原用于生产疫苗。本专利技术中由于A型口蹄疫病毒VP1基因被稳定整合到粗糙型布鲁氏菌活疫苗RA343基因组中，因此只需要按本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一株重组A型口蹄疫病毒VP1基因的粗糙型布鲁氏菌疫苗，其特征在于该疫苗免疫动物后能同时实现对布病和A型口蹄疫的双重免疫保护，其生产菌株是一株含有能够高效表达A型口蹄疫病毒VP1基因的的重组粗糙型布鲁氏菌RA343‑VP1‑FMDV‑A株(简称布鲁氏菌RA343‑VP1‑FMDV‑A株)，该菌株是通过将P3启动子与VP1序列进行密码子优化，人工合成基因片段，并构建含有P3‑VP1(FMDV‑A)序列及布鲁氏菌上下游同源臂的蔗糖自杀质粒载体pUC/P3‑VP1+，将A型口蹄疫病毒VP1基因表达框部分无痕插入到布鲁氏菌基因组中，通过氨苄蔗糖双筛选筛选出阳性克隆，并进行传代培养，通过PCR及测序鉴定其稳定性，获得牛种布鲁氏菌(Bovine brucella)重组布鲁氏菌RA343‑VP1‑FMDV‑A株，并于2019年03月14日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.17332。
【技术特征摘要】
1.一株重组A型口蹄疫病毒VP1基因的粗糙型布鲁氏菌疫苗，其特征在于该疫苗免疫动物后能同时实现对布病和A型口蹄疫的双重免疫保护，其生产菌株是一株含有能够高效表达A型口蹄疫病毒VP1基因的的重组粗糙型布鲁氏菌RA343-VP1-FMDV-A株(简称布鲁氏菌RA343-VP1-FMDV-A株)，该菌株是通过将P3启动子与VP1序列进行密码子优化，人工合成基因片段，并构建含有P3-VP1(FMDV-A)序列及布鲁氏菌上下游同源臂的蔗糖自杀质粒载体pUC/P3-VP1+，将A型口蹄疫病毒VP1基因表达框部分无痕插入到布鲁氏菌基因组中，通过氨苄蔗糖双筛选筛选出阳性克隆，并进行传代培养，通过PCR及测序鉴定其稳定性，获得牛种布鲁氏菌(Bovinebrucella)重组布鲁氏菌RA343-VP1-FMDV-A株，并于2019年03月14日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCCNo.17332。2.如权利要求1所述的一种重组粗糙型布鲁氏菌疫苗，其特征在于其生产用重组布鲁氏菌RA343-MOMP株区别于其他细菌的特异性是采用一对分别针对布鲁氏菌基因组和A型口蹄疫病毒VP1基因的特异性PCR引物(序列21，序列22)，扩增出大小为1529bp的特异性片段(序列...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙石静，王芳，蒋卉，朱良全，秦玉明，许冠龙，丁家波，彭小薇，冯宇，范学政，王楠，
申请(专利权)人：中国兽医药品监察所，
类型：发明
国别省市：北京,11
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