一种兽用A型产气荚膜梭菌类毒素的制备方法及其应用技术

技术编号:21472972 阅读:43 留言:0更新日期:2019-06-29 03:01
本发明专利技术公开了一种兽用A型产气荚膜梭菌类毒素的制备方法及其应用。所述类毒素制备方法如下:将A型产气荚膜梭菌生产菌株接种于培养基中发酵培养,得到发酵产物,然后将发酵产物在L‑赖氨酸、甲醛水溶液和pH6.8下灭活脱毒,灭活脱毒合格的菌液离心上清即为类毒素。所述培养基包括如下物质:酪蛋白胨、酵母浸粉、CaCl2、ZnSO4·7H2O、Na2HPO4·12H2O、KH2PO4、葡萄糖。按本发明专利技术方法制备的A型产气荚膜梭菌毒素的毒力最高可提至制苗标准的12.5倍,用其制备的类毒素在家兔上的一免、二免血清中和效价也分别最高可提至传统工艺的4和50倍,血清效价成本比可最高提至传统工艺的48.8、1216.4倍。

【技术实现步骤摘要】
一种兽用A型产气荚膜梭菌类毒素的制备方法及其应用
本专利技术属于兽用生物制品领域,具体涉及一种兽用A型产气荚膜梭菌类毒素的制备方法及其应用。
技术介绍
产气荚膜梭菌(C.perfringens)旧名魏氏梭菌(C.welchii)或产气荚膜杆菌(Bacillusperfringens),是引起各种动物坏死性肠炎、肠毒血症,人类的食物中毒和创伤性气性坏疽的主要病原菌之一,广泛分布于土壤及动物的消化道内。该菌能产生强烈毒性的外毒素和一些与侵袭力有关的酶类,有的菌株还可产生肠毒素、溶血素和血凝素等。传统上以其产生的4种主要外毒素的不同,可将其分为A(α)、B(α、β、ε)、C(α、β)、D(α、ε)、E(α、ι)5个型(陆承平.兽医微生物学[M].北京:中国农业出版社,2013:194-196.)。产气荚膜梭菌α毒素(CPA)在各型菌都产生,以A型菌表达水平最高,是最基本最重要的毒力因子,分子质量为42.528kDa,是锌依赖蛋白酶。A型产气荚膜梭菌是引起创伤性气性坏疽的重要致病菌,是潜在的毒素战剂之一。此外,A型产气荚膜梭菌对我国养殖业亦构成严重威胁,每年各地仔猪红痢、反刍动物的坏死性肠炎或肠毒血症的发病率成上升趋势。最近发现,A型产气荚膜梭菌可能是家畜“猝死症”的主要致病菌。欧美预防该病的生物制品有A型产气荚膜梭菌类毒素(AnimalandPlantHealthInspectionService,USDA.9CFRCh.I(1-1-07Edition)[S].Washington:U.S.GOVERNMENTPRINTINGOFFICE,2007.3、BritishPharmacopoeia(Veterinary)[S].London:TheStationeryOffice,2005.);我国含有该组分的疫苗包括:兔产气荚膜梭菌病(A型)灭活疫苗(每年约271.4万头份)和仔猪产气荚膜梭菌病二价灭活疫苗(A、C型)(每年约31.4万头份)。目前市场上使用的疫苗普遍以牛肉和肝脏的酶消化液为原材料来制备培养基,用这种方法制备培养基其制备过程繁琐、耗时长、需要人力多,尤为重要的是常因原材料质量参差不齐出现产毒性能不稳定的现象,这影响了疫苗的质量,也给疫苗生产带来了极大的浪费和高额的成本。另外,致病性梭菌的毒力与免疫效果有明显的正相关性。破伤风梭菌、诺维梭菌和肉毒梭菌的产毒能力较强,其制苗时规定的毒力标准分别至少为2000000MLD/mL、2000MLD/mL、50000MLD/mL,效力检验规定的攻毒剂量分别为300MLD、50MLD和10MLD;产气荚膜梭菌的产毒能力相对较弱,质量标准中效力检验规定的攻毒剂量为1MLD。而在A、B、C、D型产气荚膜梭菌中,D型菌的产毒能力最强(1333~10000MLD/mL),A型菌的产毒能力最弱(10~100MLD/mL),A型产气荚膜梭菌疫苗的免疫保护效果也相对最差(中国兽药典委员会编.中华人民共和国兽药典二○一○年版三部[S].北京:中国农业出版社,2011;农业部兽用生物制品规程委员会编.中华人民共和国兽用生物制品规程二○○○版[S].北京:化学工业出版社,2000)。因此,研发出质量可靠、产毒力高、稳定性好且成本低廉的A型产气荚膜梭菌毒素制备方法及可产生良好免疫效果的类毒素显得尤为必要和迫切。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种兽用A型产气荚膜梭菌类毒素的制备方法及应用。第一方面,本专利技术提供了一种A型产气荚膜梭菌发酵培养基。本专利技术提供的A型产气荚膜梭菌发酵培养基,包括溶质;所述溶质由如下物质组成:酪蛋白胨、酵母浸粉、CaCl2、ZnSO4·7H2O、Na2HPO4·12H2O、KH2PO4和葡萄糖。进一步的,所述酪蛋白胨、所述酵母浸粉、所述CaCl2、所述ZnSO4·7H2O、所述Na2HPO4·12H2O、所述KH2PO4和所述葡萄糖的质量比可为(20-30):(10-15):(0.075-0.1):(0.0014-0.0028):(5-7.5):(0.5-0.75):10。更进一步的,所述酪蛋白胨、所述酵母浸粉、所述CaCl2、所述ZnSO4·7H2O、所述Na2HPO4·12H2O、所述KH2PO4和所述葡萄糖的质量比为30:15:0.1:0.0014:5:0.5:10。上述培养基中,所述培养基还包括溶剂;所述溶剂具体可为水。所述培养基由所述酪蛋白胨、所述酵母浸粉、所述CaCl2、所述ZnSO4·7H2O、所述Na2HPO4·12H2O、所述KH2PO4和所述葡萄糖和水组成;进一步的,所述酪蛋白胨在所述培养基中的浓度为20-30g/L;所述酵母浸粉在所述培养基中的浓度为10-15g/L;所述CaCl2在所述培养基中的浓度为0.075-0.1g/L;所述ZnSO4·7H2O在所述培养基中的浓度为0.0014-0.0028g/L;所述Na2HPO4·12H2O在所述培养基中的浓度为5-7.5g/L;所述KH2PO4在所述培养基中的浓度为0.5-0.75g/L;所述葡萄糖在所述培养基中的浓度为10-15g/L。更进一步的,所述酪蛋白胨在所述培养基中的浓度为30g/L;所述酵母浸粉在所述培养基中的浓度为15g/L;所述CaCl2在所述培养基中的浓度为0.1g/L;所述ZnSO4·7H2O在所述培养基中的浓度为0.0014g/L;所述Na2HPO4·12H2O在所述培养基中的浓度为5g/L;所述KH2PO4在所述培养基中的浓度为0.5g/L;所述葡萄糖在所述培养基中的浓度为10g/L。上述培养基中,所述培养基的pH值为7.5-7.7。第二方面,本专利技术提供了一种制备上述培养基的方法。本专利技术提供的制备上述培养基的方法包括如下步骤:将上述培养基中除葡萄糖外其余各组分按照质量比与水混匀,并调节pH值至7.5-7.7,灭菌后,再将葡萄糖单独配制成50%葡萄糖水溶液灭菌,使用前加入至所需浓度,得到培养基。进一步的,使用前加入50%葡萄糖水溶液,使葡糖糖在培养基中的终浓度为0.5%。上述制备培养基的方法中,在溶解溶质的过程中,可通过加热的方式使物质充分溶解和/或加速溶解。上述制备培养基的方法中,所述调节pH值具体可采用10M的氢氧化钠溶液进行调节。上述制备培养基的方法中,所述培养基灭菌的条件可为116℃高压灭菌30min,50%葡萄糖水溶液灭菌的条件可为110℃高压灭菌40min。上述制备培养基的方法中,所述水优选为纯化水。上述培养基或上述制备培养基的方法在制备A型产气荚膜梭菌毒素和/或A型产气荚膜梭菌类毒素中的应用也属于本专利技术保护的范围。第三方面,本专利技术提供了一种制备A型产气荚膜梭菌毒素的方法。本专利技术提供的制备A型产气荚膜梭菌毒素的方法包括如下步骤:将A型产气荚膜梭菌生产菌株在上述培养基中发酵培养,得到发酵产物;收集发酵产物的上清液,得到A型产气荚膜梭菌毒素。上述制备A型产气荚膜梭菌毒素的方法中,所述A型产气荚膜梭菌生产菌株具体可为兽用A型产气荚膜梭菌C57-1菌株(CVCC编号:37),购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心(www.cvcc.org.cn,简称CVCC)。上述制备A型产气荚膜梭菌毒素的方法中,所述发酵培养的条件为如下:35-37℃发酵培养5-6h,且发酵本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种A型产气荚膜梭菌发酵培养基,包括溶质;所述溶质由如下物质组成:酪蛋白胨、酵母浸粉、CaCl2、ZnSO4·7H2O、Na2HPO4·12H2O、KH2PO4和葡萄糖。

【技术特征摘要】
1.一种A型产气荚膜梭菌发酵培养基,包括溶质;所述溶质由如下物质组成:酪蛋白胨、酵母浸粉、CaCl2、ZnSO4·7H2O、Na2HPO4·12H2O、KH2PO4和葡萄糖。2.根据权利要求1所述的培养基,其特征在于:所述酪蛋白胨、所述酵母浸粉、所述CaCl2、所述ZnSO4·7H2O、所述Na2HPO4·12H2O、所述KH2PO4和所述葡萄糖的质量比为(20-30):(10-15):(0.075-0.1):(0.0014-0.0028):(5-7.5):(0.5-0.75):10;或,所述酪蛋白胨、所述酵母浸粉、所述CaCl2、所述ZnSO4·7H2O、所述Na2HPO4·12H2O、所述KH2PO4和所述葡萄糖的质量比为30:15:0.1:0.0014:5:0.5:10。3.根据权利要求1或2所述的培养基,其特征在于:所述培养基还包括溶剂;或,所述溶剂为水;或,所述培养基由所述酪蛋白胨、所述酵母浸粉、所述CaCl2、所述ZnSO4·7H2O、所述Na2HPO4·12H2O、所述KH2PO4和所述葡萄糖和水组成;或,所述酪蛋白胨在所述培养基中的浓度为20-30g/L;所述酵母浸粉在所述培养基中的浓度为10-15g/L;所述CaCl2在所述培养基中的浓度为0.075-0.1g/L;所述ZnSO4·7H2O在所述培养基中的浓度为0.0014-0.0028g/L;所述Na2HPO4·12H2O在所述培养基中的浓度为5-7.5g/L;所述KH2PO4在所述培养基中的浓度为0.5-0.75g/L;所述葡萄糖在所述培养基中的浓度为10-15g/L;或,所述酪蛋白胨在所述培养基中的浓度为30g/L;所述酵母浸粉在所述培养基中的浓度为15g/L;所述CaCl2在所述培养基中的浓度为0.1g/L;所述ZnSO4·7H2O在所述培养基中的浓度为0.0014g/L;所述Na2HPO4·12H2O在所述培养基中的浓度为5g/L;所述KH2PO4在所述培养基中的浓度为0.5g/L;所述葡萄糖在所述培养基中的浓度为10g/L;或,所述培养基的pH值为7.5-7.7。4.一种制备权利要求1-3中任一所述的培养基的方法,包括如下步骤:将权利要求1-3中任一所述的培养基中除葡萄糖外其余各组织按...

【专利技术属性】
技术研发人员:彭小兵彭国瑞李旭妮蒋玉文
申请(专利权)人:中国兽医药品监察所
类型:发明
国别省市:北京,11

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