本发明专利技术涉及一种无毒性破伤风毒素和产气荚膜梭菌β毒素重组融合蛋白。本发明专利技术系采用经过密码子优化、破伤风梭菌毒素C片段与含有多个氨基酸突变的产气荚膜梭菌β毒素突变体的重组融合蛋白，即最大限度地保留两种毒素蛋白的免疫原性，又避免了单个氨基酸突变带来的生物安全隐患。该重组融合蛋白可用来制备破伤风梭菌、B型产气荚膜梭菌和C型产气荚膜梭菌的单位疫苗，与我国目前商品化的梭菌类天然毒素灭活疫苗相比，具有制备工艺简单、免疫剂量低、疫苗效力优良等优点，并大大降低了疫苗生产过程中的生物安全风险，是上述三种梭菌毒素疫苗升级换代的理想候选疫苗抗原；而且在与其它抗原共同制备联苗时，无需增大联苗的使用剂量，即可制备联苗。
【技术实现步骤摘要】
一种无毒性破伤风毒素和产气荚膜梭菌β毒素重组融合蛋白
本专利技术涉及一种无毒性破伤风毒素和产气荚膜梭菌β毒素重组融合蛋白。属于生物制品领域。
技术介绍
破伤风梭菌和产气荚膜梭菌是能够引起人和多种动物发病的厌氧菌，对人类的健康和畜禽养殖业危害极大，而这两种类型的梭菌的致病因素均是菌体分泌的外毒素。破伤风梭菌只含有一种外毒素，被称为破伤风毒素(Tetanustoxin，TT)，而产气荚膜梭菌的外毒素至少有20种，但以α(CPA)、β(CPB)、ε(ETX)和ι(CPI)这4种外毒素最为主要，并可据此将该菌分为A，B，C，D，E5个毒素型(Revitt-Mills,S；Rood,J；Adams,V.Clostridiumperfringensextracellulartoxinsandenzymes:20andcounting.Microbiol.Aust.2015,36,114–117.)。由于破伤风梭菌病和产气荚膜梭菌病均具有发病突然，死亡迅速等特点，因此，疫苗免疫是防控上述两类疾病的主要手段。目前，使用的商品化梭菌疫苗主要是灭活疫苗，如羊快疫、猝疽、羔羊痢疾、肠毒血症三联四防灭活苗以及羊梭菌病多联干粉苗。其中，破伤风主要是由破伤风毒素(TT)引起，而猝疽和羔羊痢疾主要与B和C型产气荚膜梭菌分泌的β毒素(CPB)有关。该类灭活疫苗在预防动物破伤风梭菌和产气荚膜梭菌所致疾病方面虽然取得了一定的效果，但这些疫苗在使用过程中仍然暴露了一些缺陷，例如疫苗免疫易引起动物局部炎症及毒性反应；其在制备过程中涉及外毒素的灭活，存在毒素外泄或灭活不彻底等生物安全隐患；此外，培养上清中的各种微小毒素以及细菌的代谢产物往往成为免疫动物的致敏原，接种动物易产生不良反应，导致免疫效果下降甚至免疫失败。因此，开发安全性好、有效抗原含量高、免疫原性强的破伤风梭菌和产气荚膜梭菌毒素基因工程疫苗，是未来的发展方向。破伤风毒素(TT)，全长1315个氨基酸，相对分子质量约150kDa，由A、B和C共3个片段组成。其中，破伤风毒素C片段(TetanustoxinCfragment，TTc)是重链的C末端，相对分子质量约为50kDa，是毒素与细胞受体的结合区域。已有研究发现，该片段在原核表达系统中可溶表达的比例较高，且具有较好的免疫原性(WellsJM,WilsonPW,NortonPM,etal.Lactococcuslactis:high-levelexpressionoftetanustoxinfragmentCandprotectionagainstlethalchallenge[J].MolecularMicrobiology,2010,8(6):1155-1162.)。β毒素(CPB)是B型和C型产气荚膜梭菌的主要致病因子，具有细胞毒性和致死性，能导致人和动物的坏死性肠炎。其中，CPB在B型和C型产气荚膜梭菌中高度保守，氨基酸同源性在99％以上。虽然外源重组CPB分子具有一定的免疫保护作用，但需要考虑到蛋白的毒性。已有的研究表明，以可溶性形式表达的重组CPB具有较强的毒力，而以包涵体形式表达的重组CPB的毒力基本上可以忽略(FerreiraMR,MoreiraGM,CunhaCE,etal.RecombinantAlpha,Beta,andEpsilonToxinsofClostridiumperfringens:ProductionStrategiesandApplicationsasVeterinaryVaccines.Toxins(Basel).2016；8(11):340.Published2016Nov21.doi:10.3390/toxins8110340)。然而，由于包涵体中的表达产物不具有生物学活性，因而需要进行变性与复性处理，而蛋白的变性与复性是一个极其复杂的过程，不同蛋白的复性条件各异，复性率往往很难提高，这是限制其应用的主要制约因素。因此，以TTc为助溶签来实现CPB的可溶性表达，一方面能够提高CPB的抗原性，从而实现一种融合蛋白预防多种疾病的效果；另一方面，避免了包涵体变性复性的繁琐工艺对抗原蛋白免疫原性的影响，减少了目的蛋白的制备时间和生产成本。本专利技术制备的一种无毒性破伤风梭菌毒素和产气荚膜梭菌β毒素重组融合蛋白，系采用宿主细胞表达经过密码子优化、含有破伤风毒素C片段(TetanustoxinCfragment，TTc)和多个氨基酸突变的β毒素的重组融合基因而获得的，即最大限度地保留天然β毒素的完整性和空间构象，从而保持其免疫原性，又避免了单个氨基酸突变带来的生物安全隐患。同时，该重组融合蛋白还具有一种融合蛋白同时预防由破伤风梭菌以及B型和C型两种产气荚膜梭菌感染所致疾病，且制备工艺简单、免疫剂量低、免疫效力好，是我国现行破伤风梭菌以及B型和C型产气荚膜梭菌灭活疫苗升级换代的理想抗原。
技术实现思路
本专利技术目的在于利用构建的表达破伤风毒素C片段(TetanustoxinCfragment，TTc)和产气荚膜梭菌β毒素(CPB)突变体重组融合蛋白的大肠杆菌制备出无毒重组融合蛋白，用于同时预防由破伤风梭菌以及B型和C型产气荚膜梭菌感染引起的疾病。本专利技术技术方案1.一种无毒性破伤风毒素和产气荚膜梭菌β毒素重组融合蛋白，其特征在于所述表达的破伤风毒素和产气荚膜梭菌β毒素重组融合蛋白(rTTc-CPBm4)与成熟的野生型破伤风毒素相比，只含有无毒的C片段；与成熟的野生型产气荚膜梭菌β毒素相比，包含多个氨基酸的突变，优选的为以下4个氨基酸突变：第212位精氨酸突变为谷氨酸，第268位的亮氨酸突变为甘氨酸，266位的酪氨酸和278位的色氨酸突变为丙氨酸；在融合蛋白的C端含有便于蛋白纯化的标签；所述重组融合蛋白是由重组表达rTTc-CPBm4的宿主细胞大肠杆菌(Escherichiacoli)的BL21(DE3)细胞株作为生产菌株制备的，该菌株被命名为大肠埃希氏菌BL/TB株，并已于2019年01月11日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCCNo.17162。2.本专利技术所述一种无毒性破伤风毒素和产气荚膜梭菌β毒素重组融合蛋白，其特征在于所述rTTc-CPBm4是用生产菌株大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)BL/TB株经发酵培养、诱导表达、菌体破碎、可溶性抗原蛋白分离纯化后获得rTTc-CPBm4。3.如权利要求2至4中任一项所述方法，其特征在于所述rTTc-CPBm4在所述宿主细胞的细胞质中表达。4.如权利要求1本专利技术所述一种无毒性破伤风毒素和产气荚膜梭菌β毒素重组融合蛋白，其特征在于编码所述rTTc-CPBm4的基因序列经过了密码子优化，更易于在大肠杆菌中实现高效表达和可溶性表达。5.本专利技术所述一种无毒性破伤风毒素和产气荚膜梭菌β毒素重组融合蛋白，其特征在于所述rTTc-CPBm4为无毒蛋白，大大降低了疫苗生产过程中的生物安全风险。6.本专利技术所述无毒性破伤风毒素和产气荚膜梭菌β毒素重组融合蛋白，其特征在于其应用：用所述表达的rTTc-CPBm4加佐剂混合制成亚单位疫苗，用来同时预防破伤风梭菌、B型和C型产气荚膜梭菌感染所致疾病。本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种无毒性破伤风毒素和产气荚膜梭菌β毒素重组融合蛋白，其特征在于所述表达的破伤风毒素和产气荚膜梭菌β毒素重组融合蛋白(rTTc‑CPBm4)与成熟的野生型破伤风毒素相比，只含有无毒的C片段；与成熟的野生型产气荚膜梭菌β毒素相比，包含多个氨基酸的突变，优选的为以下4个氨基酸突变：第212位精氨酸突变为谷氨酸，第268位的亮氨酸突变为甘氨酸，266位的酪氨酸和278位的色氨酸突变为丙氨酸；在rTTc‑CPBm4的C端含有便于蛋白纯化的标签；所述重组融合蛋白是由重组表达rTTc‑CPBm4的宿主细胞大肠杆菌(Escherichia coli)的BL21(DE3)细胞株作为生产菌株制备的，该菌株被命名为大肠埃希氏菌BL/TB株，并已于2019年01月11日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC No.17162。
【技术特征摘要】
1.一种无毒性破伤风毒素和产气荚膜梭菌β毒素重组融合蛋白，其特征在于所述表达的破伤风毒素和产气荚膜梭菌β毒素重组融合蛋白(rTTc-CPBm4)与成熟的野生型破伤风毒素相比，只含有无毒的C片段；与成熟的野生型产气荚膜梭菌β毒素相比，包含多个氨基酸的突变，优选的为以下4个氨基酸突变：第212位精氨酸突变为谷氨酸，第268位的亮氨酸突变为甘氨酸，266位的酪氨酸和278位的色氨酸突变为丙氨酸；在rTTc-CPBm4的C端含有便于蛋白纯化的标签；所述重组融合蛋白是由重组表达rTTc-CPBm4的宿主细胞大肠杆菌(Escherichiacoli)的BL21(DE3)细胞株作为生产菌株制备的，该菌株被命名为大肠埃希氏菌BL/TB株，并已于2019年01月11日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCCNo.17162。2.如权利要求1所述一种无毒性破伤风毒素和产气荚膜梭菌β毒素重组融合蛋白，其特征在于所述rTTc-CPBm4是用生产菌株大肠埃希氏菌BL/TB株经发酵培养、诱导表达、菌体破碎、可溶性抗原蛋白分离纯化后获得。3.如权利要求1所述一种无毒性破伤风毒素和产气荚膜梭菌β毒素重组融...
【专利技术属性】
技术研发人员：杜吉革，刘莹，王磊，陈小云，李旭妮，李启红，朱真，薛麒，张莹辉，姚文生，印春生，
申请(专利权)人：中国兽医药品监察所，
类型：发明
国别省市：北京,11
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