呼吸道病原体检测方法技术

本发明专利技术公开了一种呼吸道病原体检测方法，包括以下步骤：1）对给定的呼吸道病原样本进行蛋白提取；2）以步骤1）提取到的蛋白为蛋白样本形成RPPA；3）对步骤2）获得的RPPA通过PWG进行微生物或病毒检测；其中，RPPA为Reverse Phase Protein Array，即反相蛋白阵列；PWG为Planar Wave Guide，即平面光导。依据本发明专利技术呼吸道病原体检测方法在样本中所含蛋白量相对较少时不容易产生漏检。

【技术实现步骤摘要】
呼吸道病原体检测方法
本专利技术涉及一种呼吸道病原体检测方法。
技术介绍
流行性感冒病毒(InfluenzaVirus)，是正粘病毒科(Orthomyxoviridae)的代表种，简称流感病毒，包括人流感病毒和动物流感病毒，人流感病毒分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三型，是流行性感冒(流感)的病原体。其中甲型流感病毒抗原性易发生变异，多次引起世界性大流行。例如1918～1919年的大流行中，全世界至少有2000万～4000万人死于流感；乙型流感病毒也对人类也较强的致病性，可在局部地区爆发流行。甲型流感病毒颗粒呈多形性，其中球形直径80～120nm，有囊膜。基因组为分节段单股负链RNA。甲型流感病毒共有8个基因节段，依据其外膜血凝素（H）和神经氨酸酶（N）蛋白抗原性不同，目前从禽类已鉴定出16个H亚型（H1～H16）和9个N亚型（N1～N9）。近一个世纪，在人间流行的流感病毒主要是H1、H2、H3和N1、N2等几种抗原构成的亚型，但流感病毒较易出现突变，可产生新型的流感病毒，造成局部地区爆发流行乃至全球大流行。2013年我国新发现人感染H7N9禽流感就在短期内蔓延至全国各地，截止目前已累计报告确诊病例近2000例，死亡率高达40%，严重威胁人民生命健康安全。检测试剂是实现早发现、早诊断、早治疗和有效降低重大新发传染病病死率的关键技术手段。目前流感诊疗的实验室检查包括血常规、血生化、病原学及相关检测及胸部影像学检查等。病原学检测是流感病毒的筛查、确认至关重要的环节。作为病毒鉴定标准的传统病原分离检测方法对培养条件及技术要求较高，且实验周期长（一般3-7天），因此不适用于大规模快速临床诊断与筛查。流感病毒核酸检测具有较高的灵敏度及特异性，作为目前较为普及的检测标准，在医疗机构有着广泛的应用，然而实时荧光定量PCR（PolymeraseChainReaction，聚合酶链式反应）技术则需要较高的设备及实验室环境要求，并存在其它一系列劣势，如操作繁琐、较易污染，操作人员要求高，针对大样本的消耗大，效率低等，因此也较难普及并在基层开展。快速抗原检测法是对病原体抗原进行检测的一大类方法。这类方法以快速检测法（RapidDiagnosticTests）为主，其中主要通过免疫法对抗原进行特异性识别鉴定，包括胶体金法，斑点ELISA法，以及直接免疫荧光法（DFA）等。胶体金法和斑点ELISA法因操作简单而被广泛应用到基层医疗机构，其操作简便性的优势得到很大的体现。然而直接免疫荧光法则对实验技术要求较高，不易进行标准化，而所有的抗原检测均存在一个技术瓶颈，即灵敏度问题。在快速检测法应用中，因抗原不可像核酸一样被复制，且临床样本，尤其是鼻/咽拭子等来源的样本所含的蛋白量的少，回收率低，因此其检测灵敏度完全依赖于检测方法本身，很容易造成漏检，并且不能实现进一步的流感亚型分型（如甲流亚型分型），更加适用于流感早期初筛，而最终定型及分型还需要通过核酸检测来完成。
技术实现思路
针对现有技术在面对样本中所含蛋白量相对较少而容易产生漏检的技术问题，本专利技术的目的在于提供一种在样本中所含蛋白量相对较少时不容易产生漏检的呼吸道病原体检测方法。依据本专利技术的实施例，提供一种呼吸道病原体检测方法，包括以下步骤：1）对给定的呼吸道病原样本进行蛋白提取；2）以步骤1）提取到的蛋白为蛋白样本形成RPPA；3）对步骤2）获得的RPPA通过PWG进行微生物或病毒检测；其中，RPPA为ReversePhaseProteinArray，即反相蛋白阵列；PWG为PlanarWaveGuide，即平面光导。上述呼吸道病原体检测方法，可选地，蛋白提取的方法为：针对痰液：t1）将痰液样本震荡混匀；t2）在痰液样本中加入裂解液，然后混合均匀，获得混合液；t3）对步骤t2）获得的混合液进行温育；t4）对温育后的混合液进行离心分离，取上清，即获得蛋白样本；针对咽拭子，第一提取方法：y11）取下咽拭子头，置于EP管内；y12）加入裂解液，裂解液完全淹没咽拭子头部；y13）对浸入裂解液的咽拭子头进行温育，促咽拭子头上的起始样本裂解；y14）将温育后的EP管置于离心机进行离心分离，取出咽拭子头，保留上清液，即获得蛋白样本；针对咽拭子，第二提取方法：y21）取下咽拭子头，将咽拭子头浸入病毒培养液中，混匀；y22）取新咽拭子，蘸取步骤y21）中的病毒培养液，新咽拭子头吸收饱和后取下，置于EP管内；y33）向EP管内加入裂解液直至淹没新咽拭子头，温育裂解；y44）将温育后的EP管置于离心机进行离心分离，取出咽拭子头，保留上清液，即获得蛋白样本。可选地，所述裂解液为AG4；针对痰液样本，裂解液与痰液的体积比为1:1。可选地，还包括对抗体芯片的验证，对抗体芯片验证的方法为：k1）对温育裂解后所获得的液体进行稀释；k2）将稀释后的液体制备到第一多孔板中；k3）将第一多孔板中的液体进一步制备到第二多孔板中，使第一多孔板中每一第一微孔适配于第二多孔板中的多个第二微孔，而在相应的多个第二微孔中制备出适配于第一微孔内液体的梯度稀释液体；k4）将梯度稀释液体制备到PWG芯片上，然后进行芯片封闭；k5）对芯片封闭后的PWG芯片进行温育；k6）对温育后的PWG芯片进行洗涤，然后进行信号读取。可选地，步骤k1）中稀释所获得的液体的浓度为0.1~0.2微克/微升。可选地，每一第一微孔与四个第二微孔对应，相对应于的梯度稀释液体的四个梯度为：100%、75%、50%、25%。可选地，PWG芯片上的芯片单元具有多个小单元，每个小单元适配一种抗体。可选地，制备PWG芯片的方法是通过微量点阵仪将梯度稀释液体制备到PWG芯片上，在PWG芯片的制备过程中，应保持50%的湿度以及16摄氏度的温度。可选地，步骤k5）在进行温育前，对芯片封闭后的PWG芯片进行浸泡洗涤，洗涤次数不少与3次，且不多于5次；其中，芯片封闭的时间不少于25分钟，且不多于35分钟。可选地，步骤k5）中，温育温度为37摄氏度，针对一抗温育时间为30分钟，针对二抗温育时间为30分钟。可选地，步骤k4）所适配抗体的稀释度为1:2500。可选地，在步骤2）前，还包括对步骤1）提取到的蛋白样本进行抗体适应性筛选的步骤。可选地，抗体适应性筛选的方法为蛋白免疫印迹法。依据本专利技术的实施例的呼吸道病原体检测方法，基于平面光导的反向蛋白阵列方法对蛋白样本的量要求相对较低。反相蛋白阵列通常应用于肿瘤中目的蛋白的检验，本专利技术将其应用于呼吸道病原体的检测，是其在呼吸道病原体检测领域中的首次应用。呼吸道病原体检测，无论初始样本是痰液还是咽拭子，所含有的蛋白样本量都非常低，容易产生误检或者漏检。而反相蛋白阵列恰好能够弥补这一缺陷，在蛋白样本量相对较少的情况下，不容易产生误检或者漏检。附图说明图1为痰液及咽拭子蛋白提取法1提取到的蛋白浓度效果对比图。图2为咽拭子蛋白提取法2提取到的蛋白浓度效果对比图。图3-1为H1N1蛋白免疫印迹法抗体验证效果图。图3-2为H3N2蛋白免疫印迹法抗体验证效果图。图3-3为H7N9蛋白免疫印迹法抗体验证效果图。图4为痰液及咽拭子样本H1抗体蛋白免疫印迹验证效果图。图5为读取的PWG（从左至右的三个芯片依次匹配的H1抗体、H3抗体、H7抗体）芯片信号本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种呼吸道病原体检测方法，其特征在于，包括以下步骤：1）对给定的呼吸道病原样本进行蛋白提取；2）以步骤1）提取到的蛋白为蛋白样本形成RPPA；3）对步骤2）获得的RPPA通过PWG进行微生物或病毒检测；其中，RPPA为Reverse Phase Protein Array ，即反相蛋白阵列；PWG为Planar Wave Guide，即平面光导。

【技术特征摘要】
1.一种呼吸道病原体检测方法，其特征在于，包括以下步骤：1）对给定的呼吸道病原样本进行蛋白提取；2）以步骤1）提取到的蛋白为蛋白样本形成RPPA；3）对步骤2）获得的RPPA通过PWG进行微生物或病毒检测；其中，RPPA为ReversePhaseProteinArray，即反相蛋白阵列；PWG为PlanarWaveGuide，即平面光导。2.根据权利要求1所述的呼吸道病原体检测方法，其特征在于，蛋白提取的方法为：针对痰液：t1）将痰液样本震荡混匀；t2）在痰液样本中加入裂解液，然后混合均匀，获得混合液；t3）对步骤t2）获得的混合液进行温育；t4）对温育后的混合液进行离心分离，取上清，即获得蛋白样本；针对咽拭子，第一提取方法：y11）取下咽拭子头，置于EP管内；y12）加入裂解液，裂解液完全淹没咽拭子头部；y13）对浸入裂解液的咽拭子头进行温育，促咽拭子头上的起始样本裂解；y14）将温育后的EP管置于离心机进行离心分离，取出咽拭子头，保留上清液，即获得蛋白样本；针对咽拭子，第二提取方法：y21）取下咽拭子头，将咽拭子头浸入病毒培养液中，混匀；y22）取新咽拭子，蘸取步骤y21）中的病毒培养液，新咽拭子头吸收饱和后取下，置于EP管内；y33）向EP管内加入裂解液直至淹没新咽拭子头，温育裂解；y44）将温育后的EP管置于离心机进行离心分离，取出咽拭子头，保留上清液，即获得蛋白样本。3.根据权利要求2所述的呼吸道病原体检测方法，其特征在于，所述裂解液为AG4；针对痰液样本，裂解液与痰液的体积比为1:1。4.根据权利要求2所述的呼吸道病原体检测方法，其特征在于，还包括对抗体芯片的验证，对抗体芯片验证的方法为：k1）对温育裂解后所获得的液体进行稀释；k2）将稀释后的液体制备到第一多孔板中；k3）将第一多孔板中的液体进一步制备到第二多孔板中，使第一多孔...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈瑜，王楠，郑书发，楼滨，
申请(专利权)人：浙江大学，山东泰乐康健生物科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33