本发明专利技术涉及生物技术领域。目的是提供一种评估卵母细胞及胚胎质量的方法，该方法具有准确率高的特点，有利于提高胚胎移植成功率，减少医疗费用。技术方案是：一种基于颗粒细胞基因表达情况评估卵及胚胎质量的方法；按以下步骤依次进行：1)在管性因素有生殖问题的取卵病人取卵日，收集其卵子外围多余的颗粒细胞；2)将收集的颗粒细胞作为样品，使用RNA提取试剂盒获得颗粒细胞样品中的总RNA；3)使用逆转录试剂盒配置混合物后在普通PCR仪中实验获得cDNA模板；4)使用实时定量PCR试剂盒，在步骤3)获得的cDNA模板中分别加入如下序列的ADAMTS1引物、HSPG2引物以及管家基因β‑actin引物。
【技术实现步骤摘要】
一种基于颗粒细胞基因表达情况评估卵及胚胎质量的方法
本专利技术涉及生物
，尤其是一种卵母细胞及胚胎质量的评估方法。
技术介绍
随着社会节奏的加快，人们不孕不育的比例逐渐上升，越来越多的患者试图通过以下方式获得试管婴儿：促排卵、取卵、体外受精、移植；但不是每一个获得的卵子都可以进一步正常发育至胚胎、正常着床、妊娠，因而寻找一些可以指示卵子质量的标记物则显得非常重要，这可以帮助我们在既有的基础上选择更加优质的胚胎进行移植。目前对卵子质量的评估主要通过从外观形态判断，包括是否有完全扩展的卵丘细胞、完全分散排列的放射冠、卵母细胞的透明带和胞质等情况，对胚胎质量的评价主要从卵裂球大小、碎片和胞质是否透明评估，仍缺乏对卵母细胞及胚胎质量的定量评估方法。颗粒细胞通常被认为与卵子质量密切相关；既往研究中发现含凝血酶敏感素1型基序的解聚素样金属蛋白酶(ADAMTS1)，属于基质金属蛋白酶(MMP)家族，与排卵相关，底物为多功能蛋白聚糖(versican)，ADAMTS1与versican结合后可以改变细胞外基质(ECM)的结构，帮助排卵。ADAMTS1敲除老鼠中发现versican的含量显著上升，排卵数显著下降。人硫酸乙酰肝素蛋白多糖2(HSPG2)的产物为基底膜聚糖(perlecan)，也是ECM的重要组成之一，在卵泡液中的一些实验说明它的含量与卵子能否成功受精有相关性。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服上述
技术介绍
存在的不足，提供一种评估卵母细胞及胚胎质量的方法，以对于生殖结局作出预测；该方法具有准确率高的特点，有利于提高胚胎移植成功率，减少医疗费用。本专利技术提供的技术方案是：一种基于颗粒细胞基因表达情况评估卵及胚胎质量的方法；按以下步骤依次进行：1)在管性因素有生殖问题的取卵病人取卵日，收集其卵子外围多余的颗粒细胞；2)将收集的颗粒细胞作为样品，使用RNA提取试剂盒获得颗粒细胞样品中的总RNA；3)使用逆转录试剂盒配置混合物后在普通PCR仪中实验获得cDNA模板；4)使用实时定量PCR试剂盒，在步骤3)获得的cDNA模板中分别加入如下序列的ADAMTS1引物、HSPG2引物以及管家基因β-actin引物：ADAMTS1Forward,AAGACGAGGACGAAGGGACTReverse,TAGCGGTGACTGGACACAAAHSPG2Forward,CCAGCTCTCTTTTGGCAACTReverse,GGTGTATCGCAACTTCCCACβ-ActinForward,GCAAAGACCTGTACGCCAAReverse,GGAGGAGCAATGATCTTGATCTTC5)采用实时定量PCR仪进行实时定量实验，获得不同样品的ADAMTS1、HSPG2、β-actin的CT值；6)使用EXCEL根据公式计算每个样品的ADAMTS1及HSPG2的相对含量，根据PCR仪原理：引物及模板cDNA在PCR仪温度的变化下可以进行成倍复制，仪器检测cDNA浓度达到一定值需要的复制倍数即为CT值，同时由于只有信使RNA(mRNA)在逆转录时可以被逆转录成为cDNA，倒推可以得到目标样品对相对β-actin的mRNA相对含量的计算公式为：ADAMTS1的mRNA相对含量＝2β-actin的CT值-ADAMTS1的CT值；HSPG2的mRNA相对含量＝2β-actin的CT值-HSPG2的CT值；7)运用EXCEL，将步骤6)获得的数据代入公式P＝1/[e2.014-78.316*HSPG2的相对含量-1.888*ADAMTS1的相对含量]，计算预测概率值P；若预测概率值大于等于0.438时可判为阳性，即判断该病人胚胎移植后可成功着床。所述步骤7)中的公式P＝1/[e2.014-78.316*HSPG2的相对含量-1.888*ADAMTS1的相对含量]，是将统计分析软件SPSS行ROC分析后得到的表1中的系数代入统计学公式：预测概率值P＝1/[e^(常量+系数1*HSPG2的相对含量+系数2*ADAMTS1的相对含量)]后得到；所述表1是统计分析软件SPSS行ROC分析过程中自动生成的方程中的变量；所述统计学公式中的变量、系数1、系数2分别为表1中第一列的常量、HSPG2以及ADAMTS1；其中常量为2.014，HSPG2为-78.316、ADAMTS1为-1.888。所述步骤7)中，预测概率值大于等于0.438的依据是：根据统计学要求诊断节点需使得灵敏度和特异度均较高，因此在ROC曲线具体值表中划定诊断点大于20％至小于80％区间，然后取该区间的两个端点作为两个诊断点，在ROC曲线具体值表中找到两个诊断点相对应的真阳性率(P1、P2)数据和假真阳性率(R1、R2)数据，再根据统计学公式：：(R1-R2):[R1-(R＝X)]＝(P1-P2):[P1-P(R＝X)]即可计算获得预测概率值P(R＝X)＝0.438。所述步骤1)中的收集，是在保证卵丘复合物的完整性的前提下，由专业胚胎实验室人员采用专业配套切割针，切取卵丘复合物外层过多的颗粒细胞。本专利技术通过对颗粒细胞中ADAMTS1及HSPG2表达mRNA情况进行定量检测，从而定量评估卵子质量，帮助预测辅助生育结局，具有以下有益效果：1、提供了一种新的预测辅助生育临床结局的方法；2、可以更加准确、标准化、定量地评估卵子质量；3、有助于选择合适的促排周期获得的胚胎进行移植，增加成功率，减少医疗费用。附图说明图1是ADAMTS1的mRNA相对含量与卵子及胚胎发育的相互关系示意图。图2是HSPG2的mRNA相对含量与卵子及胚胎发育的相互关系示意图。图3是ADAMTS1的mRNA相对含量对预测胚胎移植后是否着床的RDC曲线图。图4是本专利技术所述方法的步骤流程图。具体实施方式以下结合附图所示的实施例，进一步说明本专利技术的形成过程。一、研究分析过程1、颗粒细胞采集对因管性因素(输卵管因素)或男方因素在浙江大学医学院附属邵逸夫医院生殖中心行辅助生育的103名患者的颗粒细胞进行了采集分析；同时对这些患者的取卵数、卵子质量情况(完成第二次减数分裂的MII期卵数、排极体率、受精率、正常受精率)、胚胎情况(可移植胚胎数、优胚数、可移植胚胎率、优胚率)、是否着床、是否正常妊娠的临床结局进行了统计。1)入选标准管性或男性因素病人：(1)年龄在20-39周岁；(2)身体质量指数(BMI)在18-26kg/m2；(3)正常月经周期；(4)管性或男性因素不孕；2)排除标准管性或男性因素病人：(1)内分泌异常；(2)基础内分泌卵泡生成素(FSH)大于10IU/l；(3)卵巢过度刺激征(OHSS)；2、实验方法1)将每一个病人获得的卵子外围的颗粒细胞作为一个样品，使用RNA提取试剂盒(QIAGENRNeasyPlusMicroKit,CatNo./ID:74034)获得颗粒细胞样品中的总RNA；2)使用逆转录试剂盒(QSelectRTSuperMixforqPCR,CatNo./ID:R132-01)获得cDNA；3)使用实时定量PCR试剂盒(SYBRGreenMasterMix，Bestar,CatNo./ID:DBI-2044)，分别加入匹配的ADAMTS1、HSPG2和管家基因β-actin引物，引物序本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于颗粒细胞基因表达情况评估卵及胚胎质量的方法；按以下步骤依次进行：1)在管性因素生殖问题的取卵病人取卵日，收集其卵子外围多余的颗粒细胞；2)将收集的颗粒细胞作为样品，使用RNA提取试剂盒获得颗粒细胞样品中的总RNA；3)使用逆转录试剂盒配置混合物后在普通PCR仪中实验获得cDNA模板；4)使用实时定量PCR试剂盒，在步骤3)获得的cDNA模板中分别加入如下序列的ADAMTS1引物、HSPG2引物以及管家基因β‑actin引物：
【技术特征摘要】
1.一种基于颗粒细胞基因表达情况评估卵及胚胎质量的方法；按以下步骤依次进行：1)在管性因素生殖问题的取卵病人取卵日，收集其卵子外围多余的颗粒细胞；2)将收集的颗粒细胞作为样品，使用RNA提取试剂盒获得颗粒细胞样品中的总RNA；3)使用逆转录试剂盒配置混合物后在普通PCR仪中实验获得cDNA模板；4)使用实时定量PCR试剂盒，在步骤3)获得的cDNA模板中分别加入如下序列的ADAMTS1引物、HSPG2引物以及管家基因β-actin引物：5)采用实时定量PCR仪进行实时定量实验，获得不同样品的ADAMTS1、HSPG2、β-actin的CT值；6)使用EXCEL根据公式计算每个样品的ADAMTS1及HSPG2的mRNA相对含量，得到每个样品相对β-actin的mRNA相对含量的计算公式为：ADAMTS1的mRNA相对含量＝2β-actin的CT值-ADAMTS1的CT值；HSPG2的mRNA相对含量＝2β-actin的CT值-HSPG2的CT值；7)运用EXCEL，将步骤6)获得的数据代入公式P＝1/[e2.014-78.316*HSPG2的相对含量-1.888*ADAMTS1的相对含量]，计算预测概率值P，若预测概率值大于等于0.438时可判为阳性，即则判断该病人胚胎移植后可成功着床。2.根据权利要求1所述的基于颗粒细胞基因表达情况评估卵及胚胎质量的方法，其特征在于：所述步骤7)中的公式P＝1/[e2.014-78...
【专利技术属性】
技术研发人员：张松英，张银丽，马烨榕，金佳敏，杨玮杰，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33
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