假单胞菌JY-Q果糖代谢基因缺失株的构建方法及应用技术

本发明专利技术分开了假单胞菌JY‑Q果糖代谢基因缺失株的构建方法及应用，以JY‑Q/5Δ为原始菌株，通过该菌全基因组信息分析，确定以下两个表达果糖磷酸转移酶的同工酶目的基因；构建目的基因的敲除载体；利用热转法将敲除载体转化到大肠杆菌缺失菌株WM3064中，以此为供体菌，假单胞菌JY‑Q为受体菌进行双亲本接合；利用载体上的Kanamycin抗性基因，筛选出第一次交换的重组子；将所得的菌株过夜扩培后，利用载体上携带的反筛选标记SacB基因，发生第二次交换的重组子，即可得到选择性降解的假单胞菌JY‑Q果糖代谢缺失株。所述的假单胞菌JY‑Q果糖代谢缺失株应用于废烟叶水提液(TWE)尼古丁的降解中。

【技术实现步骤摘要】
假单胞菌JY-Q果糖代谢基因缺失株的构建方法及应用
本专利技术属于环境微生物代谢工程
，通过基因编辑技术将假单胞菌JY-Q(Pseudomonassp.JY-Q)中催化果糖代谢起始步骤的酶基因敲除，获得果糖代谢缺失株，可应用其在尼古丁和果糖共存环境中(如废烟叶水提液,TWE)更高效地降解尼古丁。技术背景尼古丁(Nicotine),又名烟碱，由C、H、N三种元素组成，是一种含氮杂环有机化合物，其分子量为162.23Da，分子式为C10H14N2，化学命名为1-甲基-2-(3-吡啶基)吡咯烷，是一种众所周知的有毒物质，其对不同的人体和环境都会产生不等的毒副作用，因此需要对尼古丁及其相关污染来源进行治理。目前，通过微生物降解环境中各种有机污染物的事例已经举不胜举，并且表现出良好的降解效果以及绿色低能耗等优势。Pseudomonassp.JY-Q分离自废烟叶水提液(TWE)，并显示出较好的尼古丁降解活性和TWE耐受适应性(详情见专利申请号：201310320679.8，中国典型培养物保藏中心保藏编号:M2013236)。JY-Q/ΔGckΔ12490Δ22860Δ11910Δ05800，Gck为葡萄糖激酶基因(AA098_22370)，12490，22860，11910和05800为四个葡萄糖脱氢酶基因(AA098_12490，22860，11910，05800)，该菌株在JY-Q的基础上通过基因编辑技术进行改造，使其在混合碳源中不利用葡萄糖，以下简称JY-Q/5Δ(详情见专利申请号：201810359550.0)；在TWE所含的单糖中，果糖与葡萄糖含量占比最高，JY-Q/5Δ已经解决了样品中以葡萄糖为碳源的情况，对尼古丁降解具有更好的选择性降解。然而，同时在基本无机盐培养基(BSM)中添加尼古丁和果糖进行尼古丁降解实验，发现果糖的存在会对JY-Q/5Δ降解尼古丁产生干扰，为了避免果糖的干扰，提高Pseudomonassp.JY-Q对尼古丁的降解效果，本文将通过基因编辑手段来引起该菌株中的第一步果糖代谢基因缺失以实现上述目的。迄今，国内外未见针对果糖第一步代谢基因的缺失对相关菌株降解尼古丁及其他污染物的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是通过基因编辑技术对JY-Q/5Δ菌株进行改造，获得一株能够在单一尼古丁碳源或混合碳源环境(果糖与尼古丁共存或含有其他碳源)中更高效地降解尼古丁的菌株。为实现专利技术目的，本专利技术采用的技术方案如下：假单胞菌JY-Q果糖代谢缺失株的构建方法，其特征在于：以JY-Q/5Δ为原始菌株，包括下述步骤：1)通过该菌全基因组信息分析，确定以下两个表达果糖磷酸转移酶的同工酶目的基因：PTS1(AA098_22670)和PTS2(AA098_23490)；2)构建目的基因的敲除载体：设计含敲除质粒部分片段的引物，在目的基因上游同源臂的正向引物5’端加入EcoRⅠ酶切位点，在目的基因下游同源臂的反向引物5’端加入BamHⅠ酶切位点，以融合PCR扩增出目的基因的上下游同源臂后，利用一步克隆法技术在体外将其与酶切后的线性载体pK18mobSacB重组；按此方法设计的PTS1引物为：上游同源臂的上游引物A1：ctatgacatgattacgaattcATGACATTGCCGAAGCCGTA；上游同源臂的下游引物A2：ACGATGATCAGGCGCATGTTCATTGGATGAGGGGGATCAGC；下游同源臂的上游引物B1：GCTGATCCCCCTCATCCAATGAACATGCGCCTGATCATCGT；下游同源臂的下游引物B2：caggtcgactctagaggatccACGCAGTTCTGGTTTCCAGT；其中合成的上游同源臂为736bp，下游同源臂为606bp，融合后上下游同源臂为1342bp；PTS2引物为：上游同源臂的上游引物A1：ctatgacatgattacgaattcTATTGGGCTTGACCAACCAGG；下游引物A2：GGAACTGCAAAAGGAGAAGGTCATGAAATGGCCAAGATCCTCACTC；下游同源臂的上游引物B1：GAGTGAGGATCTTGGCCATTTCATGACCTTCTCCTTTTGCAGTTCC；下游同源臂的下游引物B2：caggtcgactctagaggatccGAACAGCGCATCGCATCG；其中合成的上游同源臂为563bp，下游同源臂为651bp，融合后上下游同源臂为1214bp；3)利用热转法将敲除载体转化到大肠杆菌缺失菌株WM3064中，以此为供体菌，假单胞菌JY-Q为受体菌进行双亲本接合；之后，由于自杀质粒载体pK18mobSacB无法在假单胞菌中独立复制，其接合转化到宿主菌株后会插入到JY-Q的基因组上；利用载体上的Kanamycin抗性基因，可筛选出第一次交换的重组子；4)将步骤3)所得的菌株过夜扩培后，利用载体上携带的反筛选标记SacB基因，在反筛选平板上，将发生第二次交换的重组子，即目的基因随整合入基因组的质粒载体脱落，从而实现基因无缝敲除；通过以上步骤，可得到选择性降解的假单胞菌JY-Q果糖代谢缺失株。所述的假单胞菌JY-Q果糖代谢缺失株应用于废烟叶水提液(TWE)尼古丁的降解中。经验证，本专利技术所得的菌株与野生型JY-Q的表型差异，主要包括生长差异、尼古丁和果糖降解差异。本专利技术所得的菌株，通过以下方法进行尼古丁和果糖降解测定：①尼古丁含量检测：取培养液适量，12,000r/min离心10min，上清液经0.25μm滤膜过滤后，使用高效液相色谱(HPLC)测定尼古丁浓度。色谱条件：色谱柱为AgilentSB-C18(4.6mm×150mm)；流动相采用水相-有机相双流动相，色谱甲醇和0.1mol·L-1KH2PO4(使用超纯水配置，pH＝3.0)，体积比为10:90；设定流速为1.0mL·min-1；设定检测波长为254nm，检测时间为5min。出峰时间在2.5min左右，峰面积与尼古丁浓度换算公式如下：Y＝0.0002X-0.037R2＝0.9991X:峰面积；Y:尼古丁浓度(g/L)②果糖含量检测：取培养液适量，12,000r/min离心10min，上清液经0.25μm滤膜过滤后，使用高效液相色谱(HPLC)测定果糖浓度。色谱条件：色谱柱为YMC-PackPolyamineⅡ(250×4.6mml.D.)；流动相采用水相-有机相混合流动相，UP水和乙腈，体积比为25:75；设定流速为1.0mL·min-1；利用Waters2414示差折光检测器检测，检测时间为20min。出峰时间在11min左右，峰面积与果糖浓度换算公式如下：Y＝12344X-9705.9R2＝0.9975X：峰面积；Y：果糖浓度(g/L)附图说明图1为双交换同源重组示意图；图2为菌落PCR验证第一次重组子；图3为菌落PCR验证第二次重组子；图4为缺失菌株PTS1基因上下游同源臂与JY-Q上下游同源臂序列对比图；图5为以果糖为唯一碳源的液体培养基中的果糖含量变化；图6为生长细胞JY-Q/5Δ与JY-Q/5Δ-ΔPTS2在含尼古丁的液体培养基中的生长曲线；图7为生长细胞JY-Q/5Δ与JY-Q/5Δ-ΔPTS2的尼古丁降解曲线；图8为100本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.假单胞菌JY‑Q果糖代谢缺失株的构建方法，其特征在于：以JY‑Q/5Δ为原始菌株，包括下述步骤：1)通过该菌全基因组信息分析，确定以下两个表达果糖磷酸转移酶的同工酶目的基因：PTS1(AA098_22670)和PTS2(AA098_23490)；2)构建目的基因的敲除载体：设计含敲除质粒部分片段的引物，在目的基因上游同源臂的正向引物5’端加入EcoRⅠ酶切位点，在目的基因下游同源臂的反向引物5’端加入BamH Ⅰ酶切位点，以融合PCR扩增出目的基因的上下游同源臂后，利用一步克隆法技术在体外将其与酶切后的线性载体pK18mobSacB重组；3)利用热转法将敲除载体转化到大肠杆菌缺失菌株WM3064中，以此为供体菌，假单胞菌JY‑Q为受体菌进行双亲本接合；利用载体上的Kanamycin抗性基因，筛选出第一次交换的重组子；4)将步骤3)所得的菌株过夜扩培后，利用载体上携带的反筛选标记SacB基因，在反筛选平板上，将发生第二次交换的重组子，即目的基因随整合入基因组的质粒载体脱落，从而实现基因无缝敲除；通过以上步骤，可得到选择性降解的假单胞菌JY‑Q果糖代谢缺失株。

【技术特征摘要】
1.假单胞菌JY-Q果糖代谢缺失株的构建方法，其特征在于：以JY-Q/5Δ为原始菌株，包括下述步骤：1)通过该菌全基因组信息分析，确定以下两个表达果糖磷酸转移酶的同工酶目的基因：PTS1(AA098_22670)和PTS2(AA098_23490)；2)构建目的基因的敲除载体：设计含敲除质粒部分片段的引物，在目的基因上游同源臂的正向引物5’端加入EcoRⅠ酶切位点，在目的基因下游同源臂的反向引物5’端加入BamHⅠ酶切位点，以融合PCR扩增出目的基因的上下游同源臂后，利用一步克隆法技术在体外将其与酶切后的线性载体pK18mobSacB重组；3)利用热转法将敲除载体转化到大肠杆菌缺失菌株WM3064中，以此为供体菌，假单胞菌JY-Q为受体菌进行双亲本接合；利用载体上的Kanamycin抗性基因，筛选出第一次交换的重组子；4)将步骤3)所得的菌株过夜扩培后，利用载体上携带的反筛选标记SacB基因，在反筛选平板上，将发生第二次交换的重组子，即目的基因随整合入基因组的质粒载体脱落，从而实现基因无缝敲除；通过以上步骤，可得到选择性降解的假单胞菌JY-Q果糖代谢缺失株。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的步骤2)中：PTS1引物为：上游同源臂的上游引物A1：ctatgacatgattacgaattcA...

【专利技术属性】
技术研发人员：钟卫鸿，章柳泽，王艳颖，何子良，胡祯怡，金维华，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33