本发明专利技术涉及一种用于检测带状疱疹病毒(VZV)的引物探针组合物，其包括用于扩增目的DNA片段的如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示序列的引物和如SEQ ID No.3所示序列的探针，还包括用于扩增内标DNA片段的如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示序列的引物和如SEQ ID No.6所示序列的探针。本发明专利技术还涉及含有上述引物探针组合物的试剂盒及利用该试剂盒检测VZV的方法。本发明专利技术根据VZV的基因保守区域设计引物和探针，通过实时荧光定量PCR技术检测VZV基因。本发明专利技术进行实时荧光定量PCR检测，大大提高了检测的灵敏度和特异性，同时减少检测时间，给VZV感染性疾病的研究以及临床精准诊断VZV感染性疾病带来很大的帮助。
【技术实现步骤摘要】
一种用于检测带状疱疹病毒的引物探针组合物、试剂盒及方法
本专利技术涉及于病毒检测
，尤其涉及一种用于检测带状疱疹病毒的引物探针组合物、试剂盒及方法。
技术介绍
水痘－带状疱疹病毒(varicella-zostervirus，VZV)是双链DNA病毒，属人类疱疹病毒α亚科3型(HHV-3)，形状呈同心圆状结构，有包膜。VZV没有动物储存宿主，人是唯一自然宿主。原发感染可引起不同严重程度的典型疾病,健康儿童感染VZV后多数症状轻微，预后良好。但在某些特殊人群，如免疫功能缺陷及使用免疫抑制剂治疗的儿童，会导致严重后果，甚至死亡。成人感染VZV后症状也甚为严重。VZV能感染儿童诱发水痘的产生，恢复后少量病毒潜伏于脊髓后根神经节或颅神经的感觉神经节中。成年后外伤、发热等因素能激活潜伏在神经节内的病毒，活化的病毒经感觉神经纤维轴突下行至所支配的皮肤区，增殖后引起带状疱疹。并发症有脑脊髓炎和眼结膜炎等。水痘是具有高传染性的世界流行性疾病，96％呈显性感染，有明显的临床症状，隐性感染仅4％，感染后可获终生免疫，一般很少发生第二次水痘感染。20岁以上尚未感染水痘者仅占8％。VZV实验室诊断包括：(1)电子显微镜检查：直接在电镜下观察VZV；(2)VZV培养：可从水痘及带状疱疹病人水疱液中分离到VZV进行细胞传代培养。但该方法费时，阳性率低；(3)血清学方法：确定个体对水痘的免疫状况，在筛检易感者，诊断不典型急性水痘、带状疱疹及疫苗效果评价方面，具有重要意义。已建立的方法较多，敏感性及特异性较高的方法有补体扩大中和试验(CENT)、免疫吸附血凝反应(IAHA)、膜抗原荧光抗体法(FAⅥA)、放射免疫法(RIA)、酶联免疫吸附法(ELISA)，尤以FAMA和ELISA较适于血清流行病学调查；ELISA由于操作简单而被推广使用；(4)细胞免疫学方法：体外以VZV持续感染的人胚肺二倍体细胞作为靶细胞的直接细胞毒试验(CTL)在某些实验室已成为检测VZV特异细胞免疫力的最敏感方法，但由于操作复杂而使应用受到较多限制；VZV皮试：稀释抗原注射于皮下，48小时后观察结果，能够很好反映VZV特异的细胞免疫状况，简便易行，可作为筛检VZV易感者、评价疫苗接种效果的方法；(5)分子生物学诊断：应用PCR技术检测VZVDNA，具有较高的敏感性和特异性。由于上述的实验室检查方法具有灵敏度低、特异性差，耗时长的缺点，检查结果经常出现假阳性或假阴性，导致疾病的误诊、漏诊。
技术实现思路
为了克服现有技术中所存在的不足，本专利技术通过生物信息学方法，根据VZVDNA片段高度保守区域设计出引物和探针组合，探索最佳反应条件，建立包含适宜组分的反应体系，在此基础上开发出一种高特异性和高灵敏度的实时荧光定量PCR方法，本专利技术利用上述引物探针组合物可同时针对VZV基因组上特异DNA目的片段和内标DNA片段进行双重荧光PCR扩增。为了实现上述目的，本专利技术采取的技术方案包括：本专利技术的第一个目的是提供一种用于检测VZV的引物探针组合物，其包括用于扩增目的DNA片段的如SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示序列的引物和如SEQIDNo.3所示序列的探针。为了进一步优化上述技术方案，本专利技术采取的技术措施还包括：进一步地，所述用于扩增目的DNA片段的引物和探针的设计过程如下：在国际权威数据库GenBank核酸数据库(Nucleotide)中下载Humanherpesvirus3的参照序列(GenBank:NC_001348.1，序列全长124884bp)，并使用免费开源的kers工具Jellyfish(http://www.cbcb.umd.edu/software/jellyfish/jellyfish-1.1.10.tar.gz)对全基因组序列进行连续切割，逐个碱基划动得到的序列长度为200的核苷酸序列库，从中优选重复较多(>＝2)的序列比对到NCBI的NT数据库，最终得到高度保守序列Spec_i37249，以此目的序列为模板，设计特异性的引物和探针。进一步地，所述引物探针组合物还包括用于扩增内标DNA片段的如SEQIDNo.4和SEQIDNo.5所示序列的引物和如SEQIDNo.6所示序列的探针。进一步地，所述内标DNA片段的序列如SEQIDNo.7所示。进一步地，所述探针的5'端标记荧光基团，所述探针的3'端标记淬灭基团；其中，所述荧光基团包括FAM、VIC、HEX、JOE、ROX、Cy5，所述淬灭基团包括BHQ1、BHQ2、TAMRA。上述荧光基团和淬灭基团可为本领域常规使用的任一合适的基团。更进一步地，所述用于扩增目的DNA片段的探针与用于扩增内标DNA片段的探针标记的荧光基团不相同，更优选为用于扩增目的DNA片段的探针采用HEX荧光基团，用于扩增内标DNA片段的探针采用FAM荧光基团，所述淬灭基团均采用TAMRA。上述引物及探针序列具体如下：目的DNA片段的上游引物：5'-ATGACAGCCCAGTGGAGAAA-3'(SEQIDNO：1)；目的DNA片段的下游引物：5'-TCATCCTCCGATGACGATCC-3'(SEQIDNO：2)；目的DNA片段的探针：5'-HEX-CGTCTTCATCCTCTTCCTCGTCGTGG-TAMRA-3'(SEQIDNO：3)；内标DNA片段的上游引物：5'-GGCATGTGGAGGAAGGTGGT-3'(SEQIDNO：4)；内标DNA片段的下游引物：5'-CCATGGACTGGCTCTCCGTT-3'(SEQIDNO：5)；内标DNA片段的探针：5'-HEX-ACGCAGCCCTGCTTCGTTCGCCG-TAMRA-3'(SEQIDNO：6)内标DNA片段的序列如下：TCACAAGCAGGAGTGTGCCAGGAGAAGGCCAAACCATCCAGTGCCGGTGGTTTGACCACGAGGAGTGCATCCTGCACGGAGTCACTGAGCTCGTGACCTCCACGCTGCTCGTCCCCTGCGCTATCGAGAGGGCACTCTCTGTGTCTCAGCTGGTGCCGCTGGCGCAGAGTGTTTTGGGCCCCTTAAAGCTCAGCATGGCTGGTTCTGGAGAGATGGAAAAGAGAAAGGATTTCCCCCATTTGGGTGCCTCGGGCATGTGGAGGAAGGTGGTCCGGCGAACGAAGCAGGGCTGCGTGAAGGGGATCTGATAACCCACGTCAACGGAGAGCCAGTCCATGG(SEQIDNO：7)。本专利技术的第二个目的是提供一种含有任一上述的引物探针组合物的用于检测VZV的试剂盒。进一步地，所述试剂盒还包括反应液，所述反应液包括热启动酶和UNG酶。更进一步地，该试剂盒包括反应液A和反应液B，其中，反应液A中组分主要有以上两组用于扩增目的DNA片段和内标DNA片段的引物和两条探针，反应液B中组分主要有热启动酶和UNG酶；进一步地，反应液A中的组分包含：50mMKCl，10mMTris-HCl(pH9.0，25℃)，0.1％TritonX-100，5mMMgCl2，0.32mMdNTP，0.4nM用于扩增目的DNA片段和内标DNA片段的引物本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于检测带状疱疹病毒的引物探针组合物，其特征在于，包括用于扩增目的DNA片段的如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示序列的引物和如SEQ ID No.3所示序列的探针。
【技术特征摘要】
1.一种用于检测带状疱疹病毒的引物探针组合物，其特征在于，包括用于扩增目的DNA片段的如SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示序列的引物和如SEQIDNo.3所示序列的探针。2.根据权利要求1所述的引物探针组合物，其特征在于，还包括用于扩增内标DNA片段的如SEQIDNo.4和SEQIDNo.5所示序列的引物和如SEQIDNo.6所示序列的探针。3.根据权利要求2所述的引物探针组合物，其特征在于，所述内标DNA片段的序列如SEQIDNo.7所示。4.根据权利要求1或2所述的引物探针组合物，其特征在于，所述探针的5'端标记荧光基团，所述探针的3'端标记淬灭基团；其中，所述荧光基团包括FAM、VIC、HEX、JOE、ROX、Cy5，所述淬灭基团包括BHQ1、BHQ2、TAMRA。5.一种含有权利要求1或2所述的引物探针组合物的用于检测带状疱疹病毒的试剂盒。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括反应液，所述反应液包括热启动酶和UNG酶。7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品，所述阴性质控品为生理盐水，所述阳性质控品为VZV标准菌株的菌悬液。8.一种检测带状疱疹病毒的方法，其特征在于，所述方法采用如权利要求5所述的...
【专利技术属性】
技术研发人员：马东礼，邢志浩，姜含芳，
申请(专利权)人：深圳市儿童医院，
类型：发明
国别省市：广东,44
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