本发明专利技术涉及一种用于检测肺炎衣原体的引物探针组合物，其包括用于扩增目的DNA片段的如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示序列的引物和如SEQ ID No.3所示序列的探针，还包括用于扩增内标DNA片段的如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示序列的引物和如SEQ ID No.6所示序列的探针。本发明专利技术还涉及含有上述引物探针组合物的试剂盒及利用该试剂盒检测肺炎衣原体的方法。本发明专利技术根据肺炎衣原体(Cpn)的基因保守区域设计引物和探针，通过实时荧光定量PCR技术检测Cpn基因。本发明专利技术进行实时荧光定量PCR检测，大大提高了检测的灵敏度和特异性，同时减少检测时间，给Cpn感染性疾病的研究以及临床精准诊断Cpn感染性疾病带来很大的帮助。
【技术实现步骤摘要】
一种用于检测肺炎衣原体的引物探针组合物、试剂盒及方法
本专利技术涉及于衣原体检测
，尤其涉及一种用于检测肺炎衣原体的引物探针组合物、试剂盒及方法。
技术介绍
肺炎衣原体(Chlamydiapneumoniae，Cpn)是衣原体的其中一种，衣原体为革兰阴性病原体，是一类能通过细菌滤器、在细胞内寄生、有独特发育周期的原核细胞性微生物。衣原体是一种比细菌小但比病毒大的生物，是专性细胞内寄生的、近似细菌与病毒的病原体，具有两相生活环。它没有合成高能化合物ATP、GTP的能力，必须由宿主细胞提供，因而成为能量寄生物，多呈球状、堆状，有细胞壁，有细胞膜，属原核细胞，一般寄生在动物细胞内。一般认为Cpn感染与鸟类及其他动物无关，人类是Cpn唯一储存宿主。人类Cpn感染呈世界性流行，不分地域、不受种族和年龄限制。人类Cpn感染一年四季均可能发生，不呈季节性特征，其流行可呈散发性或爆发性传播，尤其在空间相对封闭、人群聚集较多、空气不太流通的公共场所。Cpn主要引起成人及青少年的非典型肺炎，亦可引起支气管炎、咽炎及扁桃体炎等急性呼吸道感染。据统计在引起肺炎的病因中是继肺炎链球菌、流感嗜血杆菌之后引起社区获得性肺炎的第三位主要病原体。老年人以肺炎多见，20岁以下的青少年，则多为支气管炎及上呼吸道感染。亦可引起支气管炎、支气管哮喘，原有支气管哮喘的患者感染Cpn后，可加重病情。少数可引起伤寒、虹膜炎、肝炎、心内膜炎、脑膜炎及结节性红斑等。实验室检查：(1)血象血白细胞计数：多正常，重症患者可升高，血沉多增快；(2)病原学检查：是确诊本病的可靠方法；(3)微量免疫荧光试验(MIF)：是目前国际上标准的且是最常用的Cpn血清学诊断方法，除性病门诊患者和娼妓特定人群外，Cpn肺炎的MIF血清学诊断可使用Cpn单一抗原，即不需要同时检测沙眼衣原体和鹦鹉热衣原体抗体；血清学诊断标准为：MIF试验IgG≥1：512和(或)IgM≥1：32，在排除类风湿因子(RF)所致的假阳性后可诊断为近期感染，双份血清抗体滴度4倍或以上升高也诊断为近期感染，1：16≤IgG<1：512为既往感染；(4)PCR法：检测CpnDNA，敏感性更高，且可和其他种衣原体区分。由于上述的实验室检查方法灵敏度低、特异性差，耗时长的缺点，检查结果经常出现假阳性或假阴性，而导致疾病的误诊、漏诊。
技术实现思路
为了克服现有技术中所存在的不足，本专利技术通过生物信息学方法，根据CpnDNA片段高度保守区域设计出引物和探针组合，探索最佳反应条件，建立包含适宜组分的反应体系，在此基础上开发出一种高特异性和高灵敏度的实时荧光定量PCR方法，本专利技术利用上述引物探针组合物可同时针对Cpn基因组上特异目的DNA片段和内标DNA片段进行双重荧光PCR扩增。为了实现上述目的，本专利技术采取的技术方案包括：本专利技术的第一个目的是提供一种用于检测Cpn的引物探针组合物，其包括用于扩增目的DNA片段的如SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示序列的引物和如SEQIDNo.3所示序列的探针。为了进一步优化上述技术方案，本专利技术采取的技术措施还包括：进一步地，所述用于扩增目的DNA片段的引物和探针的设计过程如下：在国际权威数据库GenBank核酸数据库(Nucleotide)中下载Chlamydophilapneumoniae的参照序列(GenBank:NC_000922.1，序列全长1230230bp)，并使用免费开源的kers工具Jellyfish(http://www.cbcb.umd.edu/software/jellyfish/jellyfish-1.1.10.tar.gz)对全基因组序列进行连续切割，逐个碱基划动得到的序列长度为200的核苷酸序列库，从中优选重复较多(>＝2)的序列，比对到NCBI的NT数据库，最终得到高度保守序列Spec_i348214。以此目的序列为模板，设计特异性的引物和探针。进一步地，所述引物探针组合物还包括用于扩增内标DNA片段的如SEQIDNo.4和SEQIDNo.5所示序列的引物和如SEQIDNo.6所示序列的探针。进一步地，所述内标DNA片段的序列如SEQIDNo.7所示。进一步地，所述探针的5'端标记荧光基团，所述探针的3'端标记淬灭基团；其中，所述荧光基团包括FAM、VIC、HEX、JOE、ROX、Cy5，所述淬灭基团包括BHQ1、BHQ2、TAMRA。上述荧光基团和淬灭基团可为本领域常规使用的任一合适的基团。更进一步地，所述用于扩增目的DNA片段的探针与用于扩增内标DNA片段的探针标记的荧光基团不相同，更优选为用于扩增目的DNA片段的探针采用HEX荧光基团，用于扩增内标DNA片段的探针采用FAM荧光基团，所述淬灭基团均采用TAMRA。上述引物及探针序列具体如下：目的DNA片段的上游引物：5'-AAGTTCTAGGTGGGTCCTTGCTT-3'(SEQIDNO：1)；目的DNA片段的下游引物：5'-TGCGGTCAATACAGGAACTGCT-3'(SEQIDNO：2)；目的DNA片段的探针：5'-HEX-ACACCAGCACCGATGGCAGAACCTGCA-TAMRA-3'(SEQIDNO：3)；内标DNA片段的上游引物：5'-GGCATGTGGAGGAAGGTGGT-3'(SEQIDNO：4)；内标DNA片段的下游引物：5'-CCATGGACTGGCTCTCCGTT-3'(SEQIDNO：5)；内标DNA片段的探针：5'-HEX-ACGCAGCCCTGCTTCGTTCGCCG-TAMRA-3'(SEQIDNO：6)内标DNA片段的序列如下：TCACAAGCAGGAGTGTGCCAGGAGAAGGCCAAACCATCCAGTGCCGGTGGTTTGACCACGAGGAGTGCATCCTGCACGGAGTCACTGAGCTCGTGACCTCCACGCTGCTCGTCCCCTGCGCTATCGAGAGGGCACTCTCTGTGTCTCAGCTGGTGCCGCTGGCGCAGAGTGTTTTGGGCCCCTTAAAGCTCAGCATGGCTGGTTCTGGAGAGATGGAAAAGAGAAAGGATTTCCCCCATTTGGGTGCCTCGGGCATGTGGAGGAAGGTGGTCCGGCGAACGAAGCAGGGCTGCGTGAAGGGGATCTGATAACCCACGTCAACGGAGAGCCAGTCCATGG(SEQIDNO：7)。本专利技术的第二个目的是提供一种含有任一上述的引物探针组合物的用于检测Cpn的试剂盒。进一步地，所述试剂盒还包括反应液，所述反应液包括热启动酶和UNG酶。更进一步地，该试剂盒包括反应液A和反应液B，其中，反应液A中组分主要有以上两组用于扩增目的DNA片段和内标DNA片段的引物和两条探针，反应液B中组分主要有热启动酶和UNG酶；进一步地，反应液A中的组分包含：50mMKCl，10mMTris-HCl(pH9.0，25℃)，0.1％TritonX-100，5mMMgCl2，0.32mMdNTP，0.4nM用于扩增目的DNA片段和内标DNA片段的引物，0.125nM用于扩增目的DNA片段和内标DNA片段的探针。反应本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于检测肺炎衣原体的引物探针组合物，其特征在于，包括用于扩增目的DNA片段的如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示序列的引物和如SEQ ID No.3所示序列的探针。
【技术特征摘要】
1.一种用于检测肺炎衣原体的引物探针组合物，其特征在于，包括用于扩增目的DNA片段的如SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示序列的引物和如SEQIDNo.3所示序列的探针。2.根据权利要求1所述的引物探针组合物，其特征在于，还包括用于扩增内标DNA片段的如SEQIDNo.4和SEQIDNo.5所示序列的引物和如SEQIDNo.6所示序列的探针。3.根据权利要求2所述的引物探针组合物，其特征在于，所述内标DNA片段的序列如SEQIDNo.7所示。4.根据权利要求1或2所述的引物探针组合物，其特征在于，所述探针的5'端标记荧光基团，所述探针的3'端标记淬灭基团；其中，所述荧光基团包括FAM、VIC、HEX、JOE、ROX、Cy5，所述淬灭基团包括BHQ1、BHQ2、TAMRA。5.一种含有权利要求1或2所述的引物探针组合物的用于检测肺炎衣原体的试剂盒。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括反应液，所述反应液包括热启动酶和UNG酶。7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品，所述阴性质控品为生理盐水，所述阳性质控品为Cpn标准菌株的菌悬液。8.一种检测肺炎衣原体的方法，其特征在于，所述方法采用如权利要求5所述的试...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘孝荣，邢志浩，姜含芳，马东礼，朱纯清，
申请(专利权)人：深圳市儿童医院，
类型：发明
国别省市：广东,44
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