本发明专利技术提供一种毛蚶热休克蛋白(90)‑‑一种新型海洋生物污染检测标记物，属于分子生物技术领域，该毛蚶热休克蛋白(90)基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，由该核苷酸序列编码的毛蚶热休克蛋白(90)氨基序列如SEQ ID NO.6所示，该毛蚶热休克蛋白(90)用作海洋污染的检测标记物。本发明专利技术蚶热休克蛋白(90)基因通过基因克隆技术克隆获得，利用毛蚶热休克蛋白(90)用作新型海洋生物污染检测标记物，该检测标记物特异性强，在分子水平上能够直接以生物体内靶细胞或靶分子为反应终点进行灵敏的生物学反应，对海洋污染物暴露和毒性效应有预警作用。
【技术实现步骤摘要】
一种新型海洋生物污染检测标记物
本专利技术涉及分子生物
，尤其是涉及一种新型海洋生物污染检测标记物。技术背景我国东海地区海域带处于海洋与陆地的过渡地带，陆地工农业生产、海洋产业开发等排放的废水多在此汇集。其中重金属、石油类(BAP)等污染物易通过吸附等作用结合到悬浮颗粒物或胶体表面而被沉淀富集，会对底栖生物产生较大的影响。有研究表明，生物组织中标志物活性(含量)与环境中污染物含量呈一定相关性，因此，研究东海海域沉积物中污染物的含量变化，能够为筛选生物标志物提供基础数据，同时有利于初步掌握不同区域的污染特征和来源，对于应用生物标志物法评价周围人类活动对海域环境的生态压力有重要作用。毛蚶(Scapharcasubcrenata)俗称毛蛤、麻蚶、瓦楞子，属于软体动物门、瓣鳃纲、翼形亚纲、蚶目、蚶科、毛蚶属，广泛分布于日本、朝鲜、中国沿岸；在中国北起鸭绿江，南至广西均有分布，以莱州湾、渤海湾、辽东湾、海州湾等浅水区的资源尤为丰富。近年来，随着工农业的迅猛发展，近海遭到不同程度的污染，特别是石油工业和海上交通运输业的发展，使得石油成为近海中最主要的污染物，石油污染不仅能使鱼、虾、贝类海产品变味，严重时能产生毒性效应，给海洋生态环境和渔业资源带了严重危害；同时，由于重金属易在底质中蓄积，不易降解，往往被生物富集，对人体健康具有潜在的威胁，重金属污染也是当今世界普遍关注的环境问题之一，特别是1931年日本发生镉中毒以来，镉污染越来越受到人们的重视。热休克蛋白(HSPs)是一种在进化上高度保守的、广泛存在于原核生物和真核生物细胞中的蛋白质家族。又被称为应激蛋白，对来自于生态环境因素的刺激反应特别敏感，热休克蛋白90是重要的组成型蛋白，HSP90与信号传导途径中的苏氨酸蛋白激酶、酪氨酸蛋白激酶和丝氨酸、类固醇激素受体(包括糖皮质激素受体，肾上腺皮质激素受体，视黄酸受体及孕激素受体等)等分子结合，调节它们之间的生物活性，防止蛋白质的聚集和热变性。HSP90在机体正常状态下就自然存在，受到外界不利环境刺激时表达加强，如缺氧、重金属离子、病毒感染、DNA损伤和自由基等刺激作用后，都可以导致细胞发生热休克反应，诱导热激蛋白的合成。所以，HSP90对污染物的应激反应广泛而敏感，在海洋生态环境的污染预警方面具有潜在的价值，在受到诱导后其表达量会显著变化，在生命活动中有非常重大的作用。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一种通过基因克隆技术克隆获得的毛蚶热休克蛋白(90)基因以及由该基因编码得到的毛蚶热休克蛋白(90)。本专利技术针对
技术介绍
中提到的问题，采取的技术方案为：本专利技术还提供一种毛蚶热休克蛋白(90)基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。作为优选，毛蚶热休克蛋白(90)基因通过基因克隆技术克隆获得，其包括如下步骤为：1)总RNA提取；2)以步骤1获得的总RNA样品作为模板，反转录合成cDNA第一链；3)利用引物扩增基因核心片段；4)利用RACE反应扩增获得毛蚶热休克蛋白(90)如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，并进行生物信息学分析。进一步优选，步骤3中引物的序列为：M1-F：5'-CGTAGGTGCGGATATGTCCAT-3'，M2-R：5'-GCTTGACAGCCAATTGGTCT-3'。步骤4中RACE反应过程中获得的5’RACE序列如SEQIDNO.4所示，3’RACE序列如SEQIDNO.5所示。本专利技术还提供一种毛蚶热休克蛋白(90)，由上述毛蚶热休克蛋白(90)基因编码。本专利技术的目的之二在于提供一种利用毛蚶热休克蛋白(90)用作新型海洋生物污染检测标记物，该检测标记物特异性强，在分子水平上能够直接以生物体内靶细胞或靶分子为反应终点进行灵敏的生物学反应，对海洋污染物暴露和毒性效应有预警作用。本专利技术还提供一种新型海洋生物污染检测标记物，上述毛蚶热休克蛋白(90)用作海洋污染的检测标记物。作为优选，检测标记物监测海洋污染情况的方法为：选择毛蚶作为检测海洋污染的生物样本，通过对受到污染区域毛蚶的解刨提取肌肉和肝脏中的RNA，反转录成DNA，用荧光定量技术检测毛蚶热休克蛋白(90)基因在肌肉和肝脏中的相对表达量，检测海洋污染程度。本专利技术利用毛蚶热休克蛋白(90)用作海洋污染的检测标记物，该检测标记物特异性强，通过检测毛蚶热休克蛋白(90)基因在肌肉和肝脏中的相对表达量，检测海洋污染程度，在分子水平上能够直接以生物体内靶细胞或靶分子为反应终点进行灵敏的生物学反应，对海洋污染物暴露和毒性效应有预警作用，同时因毛蚶热休克蛋白(90)基因具有较强的应激敏感性、易于检测分析，也可以用于毛蚶的人工养殖，及时发现病害以及水质恶化，减少经济损失。进一步优选，荧光定量技术用引物为：HSP90-F：5'-CGCAATGTTGAGTCGCTCGGC-3'，HSP90-R：5'-GCCTAGTTGTCAAGTAGTCC-3'；actin-real-F1：5'-TGCCATTCAGGCCGTATTGT-3'，actin-real-R1：5'-CCGGCAAGATCCAACCTCAT-3'。进一步优选，毛蚶热休克蛋白(90)基因在肌肉和肝脏中的相对表达量的值越大，海洋污染程度越大，反之，相对表达量的值越小，海洋污染程度越小。重金属、壬基酚单一及联合暴露能够引起毛蚶发生氧化应激，从而诱导肌肉和肝脏组织中毛蚶热休克蛋白(90)基因水平上升，进而能够引起肌肉和肝脏组织中的热休克蛋白的过表达，提高其中毛蚶热休克蛋白(90)的含量，利用该变化可以有效地检测海洋污染。本专利技术还提供一种新型海洋生物污染检测标记物在海洋中壬基酚和/或铜和/或镉检测或监控中的应用。与现有技术相比，本专利技术的优点在于：1)本专利技术首次通过基因克隆技术克隆毛蚶热休克蛋白(90)的基因核心片段获得毛蚶热休克蛋白(90)，其生物信息学分析发现在毛蚶的血细胞和腮中毛蚶热休克蛋白(90)基因的相对表达量最高，可以用于检测海洋污染；2)本专利技术PCR反应体系能够提高rTaq酶的保真性和活性、减少碱基的堆积，使rTaq酶更容易作用于模板，提高PCR扩增的得到目标产物，提高引物和模板的结合度，保证扩增反应的特异性、提高PCR扩增效率；3)本专利技术利用毛蚶热休克蛋白(90)用作海洋污染的检测标记物，该检测标记物特异性强，在分子水平上能够直接以生物体内靶细胞或靶分子为反应终点进行灵敏的生物学反应，对海洋污染物暴露和毒性效应有预警作用。具体实施方式下面通过实施例对本专利技术方案作进一步说明：实施例1：一种毛蚶热休克蛋白(90)基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。毛蚶热休克蛋白(90)基因通过基因克隆技术克隆获得，其包括如下步骤为：1)总RNA提取：以毛蚶作为材料，提取各组织总RNA；取无RNA酶的2mlEP管，用的枪头加入500ulTrizol，用酒精泡过的镊子夹取脑组织样品溶于Trizol液体中，电动匀浆器研磨直到组织完全溶解于液体中，补满Trizol到1mL，4℃，12000rpm，10min离心，取上清液放进1.5mLEP管中，不能吸到杂质，然后加入200ul的氯仿，剧烈震荡，室温静置5分钟，4℃，12000rpm，15min离心，取三层中的最上层液体到新的1.5mLEP管中，加本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.毛蚶热休克蛋白(90)基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
【技术特征摘要】
1.毛蚶热休克蛋白(90)基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.根据权利要求1所述的毛蚶热休克蛋白(90)基因，其特征在于：所述毛蚶热休克蛋白(90)基因通过基因克隆技术克隆获得，其包括如下步骤为：1)总RNA提取；2)以步骤1获得的总RNA样品作为模板，反转录合成cDNA第一链；3)利用引物扩增基因核心片段；4)利用RACE反应扩增获得毛蚶热休克蛋白(90)如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，并进行生物信息学分析。3.根据权利要求2所述的毛蚶热休克蛋白(90)基因，其特征在于：所述步骤3中引物的序列为：M1-F：5'-CGTAGGTGCGGATATGTCCAT-3'，M2-R：5'-GCTTGACAGCCAATTGGTCT-3'。4.根据权利要求2所述的毛蚶热休克蛋白(90)基因，其特征在于：所述步骤4中RACE反应过程中获得的5’RACE序列如SEQIDNO.4所示，3’RACE序列如SEQIDNO.5所示。5.毛蚶热休克蛋白(90)，其特征在于：由权利要求1-4任一项所述的毛蚶热休克蛋白(90)基因编码。6.一种新型海洋生物污染检测标记物，其特征在于：权利要求5所述的毛蚶热休克蛋白(90)用作海...
【专利技术属性】
技术研发人员：祁鹏志，郭宝英，董文强，任世太，
申请(专利权)人：浙江海洋大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33
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