一种聚合物微囊包埋固定化酶的方法技术

一种聚合物微囊包埋固定化酶的方法，属于固定化酶制备领域。本发明专利技术分为以下的步骤：第一步、制备包埋固定化酶的碳酸钙微球；第二步、在包埋酶的碳酸钙微球表面吸附一层带正电荷的聚合物；第三步、在可见光的照射下，利用光引发剂引发聚合反应，在吸附聚合物后包埋酶的碳酸钙微球表面接枝交联聚合物层；第四步、除去碳酸钙，制备包裹酶的微囊。本技术在室温和可见光下固定化酶，反应条件温和，有利于酶活性的保持。固定化提高了酶的稳定性，实现了酶的重复利用。

【技术实现步骤摘要】
一种聚合物微囊包埋固定化酶的方法
本专利技术属于固定化酶的制备
，涉及包埋酶的碳酸钙微球表面进行可见光接枝交联聚合，然后将碳酸钙溶出形成聚合物微囊固定化酶。
技术介绍
由于生物酶反应比化学反应条件温和，选择性好，反应的副反应产物更少，且很多难以合成的反应和具有特殊异构的产物都可以通过一种或多种酶来完成。所以酶制剂具有巨大的市场潜力，是实现绿色化学、可持续发展的重要技术手段之一。但是酶制剂也有一定的缺陷，酶在特殊条件下容易变性失活，在高温、强碱、强酸和紫外线等条件下都会影响其活性。酶在反应后与产物混合难以分离，不仅污染产物，不利于实际应用，而且不能重复利用提高了使用成本。为了解决这一问题，满足工业化应用，需要对酶进行固定化。目前常用的酶固定化的方法有，物理吸附法、包埋固定法、酶交联法和共价键结合法。包埋法不通过物理或者化学的作用将酶固定化在载体之上，可以最大程度的保留酶的天然活性，也有利于酶的回收。同时在催化反应过程中，由于载体的保护作用，可以有效地保护酶的空间构象，保留了酶的活性。赵国芬等(CN104974996A)以碳酸钙和亚油酸异构酶共沉淀得到的无定型碳酸钙晶体为模板，利用聚丙烯胺盐酸盐(PAH)/聚苯乙烯磺酸钠(PSS)层层自组装的方法，形成聚合物包覆层，制备出具有高活性、较好稳定性、半衰期长的亚油酸异构酶微胶囊。Kreft等(AngewandteChemieInternationalEdition,2010,46,5605)利用聚丙烯胺盐酸盐(PAH)/聚苯乙烯磺酸钠(PSS)层层自组装的方法，将葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶固定在聚合物微囊中。同时对两种酶进行固定化，方法成本低，且反应简单。在包埋酶的碳酸钙微球表面利用层层自组装的方法包埋固定化酶，虽然方法简单迅速，但是聚合物微囊的厚度薄，稳定性差。本专利技术利用可见光在包埋酶的碳酸钙微球表面引发接枝聚合，接枝上交联网状聚合物层，除去碳酸钙后形成微囊包埋固定化酶。由于可见光可控接枝聚合，反应条件温和，对酶活性的影响小，且制备的微囊由共价键交联，稳定性好、厚度可控。实现了对酶的固定化和回收再利用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种利用可见光引发接枝聚合，在包埋酶的碳酸钙微球表面引发接枝上一层聚合物交联层，进而通过去除碳酸钙核制备出固定化酶微囊的方法。该方法反应条件温和，步骤简单，能够制备出可控厚度的微胶囊同时实现对酶的有效包埋固定化。为了达到上述的目的，本专利技术按照以下技术方案实现：第一步、制备包埋固定化酶的碳酸钙微球；第二步、在包埋酶的碳酸钙微球表面吸附一层带正电荷的聚合物；第三步、在可见光的照射下，利用光引发剂引发聚合反应，在吸附聚合物后包埋酶的碳酸钙微球表面接枝交联聚合物层；第四步、除去碳酸钙，制备包裹酶的微囊。所述第一步中形成包埋酶的碳酸钙微球的溶液组成为：一定浓度的氯化钙、碳酸钠和酶溶液。直接混合搅拌，形成包埋酶的碳酸钙微球。溶液中酶的浓度为0.1-3mg/mL，氯化钙、碳酸钠的浓度均为0.1-0.5mol/L。所述第二步中碳酸钙微球表面吸附上的带正电荷的聚合物，聚合物为聚乙烯亚胺、聚丙烯胺盐酸盐或聚赖氨酸，吸附时间为5-20min；吸附反应的溶液组成如下：包埋酶的碳酸钙微球质量百分含量为0.01-3wt％，聚合物质量百分含量为0.01-3wt％，余量是pH值在7-10的缓冲液。所述第三步中可见光接枝聚合溶液的组成如下：单体质量百分含量为3-30wt％，吸附聚合物后包埋酶的碳酸钙微球质量百分含量为0.01-5wt％，引发剂质量百分含量为0.005-0.5wt％，余量是水或者pH为7-10的缓冲液。光反应时间为30-180分钟，波长420nm处光强为2000μW/cm-2-12000μW/cm-2。所述光引发剂为硫杂蒽酮的衍生物，硫杂蒽酮儿茶酚-O,O′-二乙酸。所述单体包括聚乙二醇双丙烯酸酯，聚乙二醇双甲基丙烯酸酯和亚甲基双丙烯酰胺中的一种或几种。完成接枝后，利用乙二胺四乙二酸溶液调节至pH＝7后除去碳酸钙核，得到包埋酶的聚合物微囊。本专利技术的优点在于：1)酶固定是在可见光条件下进行的，用的溶剂是水或者接近中性的缓冲液，反应温度是室温，对酶的伤害小有利于酶活的保存。2)接枝交联聚合呈可控/活性特征，能够得到网孔大小均匀、厚度可控、结构稳定的交联微囊。实现了对酶的固定化和回收再利用。具体实施方式下面结合实例对本专利技术作详细的说明，但并不构成对本专利技术的限制。实施实例1：取含有0.6mol/L氯化钙和3mg/mL葡糖氧化酶的混合溶液10mL，搅拌均匀，加入等体积的0.6mol/L碳酸钠溶液，磁力搅拌反应5min，离心清洗后待用。取包埋酶的碳酸钙微球0.5g，加入到质量分数为1％的聚乙烯亚胺溶液中，溶液体积50mL，聚乙烯亚胺溶液中溶剂是pH＝7的磷酸盐缓冲液，磁力搅拌下吸附反应20min，离心清洗后待用。取吸附聚乙烯亚胺后包埋酶的碳酸钙微球0.5g，光引发剂硫杂蒽酮儿茶酚-O,O′-二乙酸0.05g，加入到含有质量分数10％的聚乙二醇双丙烯酸酯(PEGDA分子量575)溶液中，溶液体积50mL，溶剂是pH＝7的磷酸盐缓冲液。密封好装置后通氮气，移入可见光灯辐照装置(波长420nm处的光强为12000μW/cm-2)，室温照射2小时后取样。利用0.2mol/L的乙二胺四乙二酸溶液调节至pH＝7后除去碳酸钙，得到载酶微囊。采用分光光度法测试酶活，葡萄糖氧化酶活力定义为：每分钟能够氧化1.0μmol的β-D-葡萄糖变成D-葡萄糖酸和H2O2的酶量为一个酶活力单位。取0.50mL底物溶液(0.1g/mL的葡萄糖溶液)，0.1mL在冰水中冷却过的过氧化物酶溶液(每毫升的此溶液中应含有60个红紫棓精单位)和2.4mL邻联二茴香胺溶液(66mg/L)滴入一只lcm比色皿内，调温至25℃，然后加0.1mL酶溶液(1mL溶液中约含有0.1U)，同时按动秒表。在连续4min内每隔lmin于436nm处测一次吸光度，一直进行到每分钟吸光度的增大值达到稳定为止。得到最佳状态下的固定化葡糖氧化酶活力为38U/mg，反复使用10次后酶活力仍保持在80％以上。实施实例2：取含有0.6mol/L氯化钙和3mg/mL葡糖氧化酶的混合溶液10mL，搅拌均匀，加入等体积的0.6mol/L碳酸钠溶液，磁力搅拌反应5min，离心清洗后待用。取包埋酶的碳酸钙微球0.25g，加入到质量分数为1％的聚乙烯亚胺溶液中，溶液体积50mL，聚乙烯亚胺溶液中溶剂是pH＝7的磷酸盐缓冲液，磁力搅拌下吸附反应20min，离心清洗后待用。取吸附聚乙烯亚胺后包埋酶的碳酸钙微球0.25g，光引发剂硫杂蒽酮儿茶酚-O,O′-二乙酸0.05g，加入到含有质量分数10％的聚乙二醇双丙烯酸酯(PEGDA分子量575)溶液中，溶液体积50mL，溶剂是pH＝7的磷酸盐缓冲液。密封好装置后通氮气，移入可见光灯辐照装置(波长420nm处的光强为12000μW/cm-2)，室温照射2小时后取样。利用0.2mol/L的乙二胺四乙二酸溶液调节至pH＝7后除去碳酸钙，得到载酶微囊。采用滴定法测量酶活，葡萄糖氧化酶活力定义为：每分钟能够氧化1.0μmol的β-D-葡萄糖变成D-葡萄糖酸和H2O2的酶量为一个酶活力单位。取250mL本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种聚合物微囊包埋固定化酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：第一步、制备包埋固定化酶的碳酸钙微球；第二步、在包埋酶的碳酸钙微球表面吸附一层带正电荷的聚合物；第三步、在可见光的照射下，利用光引发剂引发聚合反应，在吸附聚合物后包埋酶的碳酸钙微球表面接枝交联聚合物层；第四步、除去碳酸钙，制备包裹酶的微囊。

【技术特征摘要】
1.一种聚合物微囊包埋固定化酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：第一步、制备包埋固定化酶的碳酸钙微球；第二步、在包埋酶的碳酸钙微球表面吸附一层带正电荷的聚合物；第三步、在可见光的照射下，利用光引发剂引发聚合反应，在吸附聚合物后包埋酶的碳酸钙微球表面接枝交联聚合物层；第四步、除去碳酸钙，制备包裹酶的微囊。2.根据权利要求1所述的聚合物微囊包埋固定化酶的方法，其特征在于氯化钙、碳酸钠、酶溶液直接混合搅拌，形成包埋酶的碳酸钙微球。3.根据权利要求2所述的聚合物微囊包埋固定化酶的方法，其特征在于形成包埋酶的碳酸钙微球，反应溶液中酶的浓度为0.1-3mg/mL，氯化钙、碳酸钠的浓度均为0.1-0.5mol/L。4.根据权利要求1所述的聚合物微囊包埋固定化酶的方法，其特征在于在包埋酶的碳酸钙微球表面吸附一层带正电荷的聚合物；所用聚合物为聚乙烯亚胺、聚丙烯胺盐酸盐或聚赖氨酸，吸附时间为5-20min；吸附反应的溶液组成如下：包埋酶的碳酸钙微球质量百分含量...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵长稳，邵广俊，张凯，马育红，杨万泰，
申请(专利权)人：北京化工大学，
类型：发明
国别省市：北京,11