本发明专利技术属于生物技术领域，具体为一种嗜热菌RNA连接酶RTCB在低温催化RNA连接和DNA环化中的应用。本发明专利技术包括：在70℃~37℃温度条件下，嗜热RTCB用于完成DNA环化激活反应，用于完成RNA环化的激活反应和RNA连接反应。本发明专利技术可应用于商业化生产，鉴于嗜热菌蛋白RTCB在纯化上的简便操作及广泛的温度适应性，将极大的拓阔其应用范围。在生物医药工业领域具有广泛的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
嗜热菌RNA连接酶RTCB在低温催化RNA连接和DNA环化中的应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种嗜热菌ThermusthermophilusRNA连接酶RTCB在RNA连接、DNA环化方面的应用。
技术介绍
RNA连接酶RTCB催化GTP及Mn离子依赖的2′，3′>P或3-PRNA与5-OHRNA的连接，RTCB催化的连接反应通过三步核酸转移过程完成：（1）RTCB与GTP反应生成一个共价的RtcB–histidine–GMP中间体并释放PPi;(2)GMP转移到RNA3-P；（3）5′-OHRNA攻击激活的3′-PRNA形成3′，5′-磷酸二酯键并释放GMP。RNA连接酶RTCB在古细菌、细菌、真核生物中都广泛存在。RTCB在催化RNA连接及DNA环化修复方面起到重要的调节作用，是完成RNA连接反应所必需的。RNA连接反应的正常进行是细胞进行正常代谢的关键，但真核RNA连接酶尤其是商业化的真核来源RTCB的价格极其昂贵，真核来源RTCB的最适反应温度为37℃，因此找到能在37℃替代真核来源RTCB最适反应温度完成RNA连接反应的原核来源RTCB可较好的解决这一问题。目前仅有嗜热RTCB在其最适反应温度70℃进行RNA连接反应的报道，其在DNA环化方面的作用目前未有报道。嗜热菌来源蛋白因其生长环境特殊，在蛋白纯化过程中很容易通过热处理去除杂蛋白而获得纯度较高的嗜热蛋白，目前对于嗜热菌Thermusthermophilus来源的RTCB的研究一般都就限于其最适反应温度70℃，而这一温度条件下对于许多热敏感反应底物是无法进行的，因此研究嗜热菌来源的RTCB在低温下能催化RNA连接和DNA环化的进行中是解决这一问题的关键。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种嗜热菌RNA连接酶在低温催化RNA连接和DNA环化中的应用，从而扩大嗜热菌RNA连接酶的应用范围，以解决真核RNA连接酶尤其是商业化的真核来源RTCB的价格昂贵问题。本专利技术涉及对嗜热菌蛋白RTCB进行密码子优化以获得在大肠杆菌中以可溶性形式表达的重组蛋白。对嗜热菌蛋白RTCB进行了密码子优化，是将该基因连接到大肠杆菌表达载体pET28上并转化到大肠杆菌Bl21(DE3)plus中，诱导表达出RTCB，经热处理、Ni亲和层析、凝胶层析纯化获得了高活性的重组RNA连接酶RTCB。嗜热菌蛋白RTCB由476个氨基酸组成，分子量52.7KD；在大肠杆菌表达菌株Bl21(DE3)plus中可溶性表达且表达量较高。其氨基酸序列为SEQ.ID.NO:1所示。本专利技术对重组RNA连接酶RTCB蛋白，在RNA连接、DNA环化上的应用进行了探索。本专利技术包括以下几个方面：本专利技术提供了在70℃~37℃温度条件下，嗜热RTCB不仅可以用于完成RNA连接反应，也可以用于完成DNA环化激活反应。进一步，本专利技术提供了在70℃~37℃温度条件下，嗜热RTCB能用于完成DNA环化的激活反应，而不能用于完成DNA连接反应，而嗜热RTCB既可用于完成RNA环化激活反应，又可用于完成RNA连接反应。进一步，本专利技术优选温度条件为65℃~37℃；更优选温度条件为55℃~37℃。进一步，本专利技术提供了在非最适反应温度下通过延长反应时间可以达到相同的效果，例如，在37℃条件下通过延长反应时间可实现嗜热来源RTCB的RNA连接和DNA激活反应。进一步，本专利技术提供了嗜热菌蛋白RTCB在RNA连接及DNA环化方面均表现出在非最适反应温度下可进行催化反应，且RNA连接反应受温度的影响更小。例如，在37℃条件下反应2h约有20%的RNA连接产物获得，在37℃条件下反应2h约有3%的DNA环化产物获得。进一步，本专利技术提供了嗜热RTCB对于RNA连接反应的催化作用明显优于对于DNA环化的激活作用。例如，在最适反应温度70℃反应30min即可完成RNA连接反应，而在70℃反应120min仍仅有30%的DNA环化产物获得。本专利技术表明，嗜热菌蛋白RTCB在低温条件下的应用，可应用于商业化生产，鉴于嗜热菌蛋白RTCB在纯化上的简便操作及广泛的温度适应性，将极大的拓阔其应用范围，在生物医药工业领域具有广泛的应用前景。附图说明图1为嗜热菌蛋白RTCB在70℃，55℃，37℃催化RNA连接反应的结果。图2为图1中Urea-page检测嗜热菌蛋白RTCB催化RNA连接反应结果的柱形图。图3为嗜热菌蛋白RTCB在70℃，55℃，37℃催化DNA激活反应的结果。图4为图3中Urea-page检测嗜热菌蛋白RTCB催化DNA激活反应结果的柱形图。图5为嗜热菌蛋白RTCB只有DNA激活作用的结果。具体实施方式下面采用具体实施例进一步说明本专利技术的内容。以下内容是结合具体的优选实施方式对本专利技术所作的进一步详细说明，不能认定本专利技术的具体实施只局限于这些说明。对于本专利技术所属
的普通技术人员来说，在不脱离本专利技术构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本专利技术的保护范围。实施例1.嗜热蛋白RTCB的表达纯化方法嗜热菌蛋白RTCB由476个氨基酸组成，分子量52.7KD；在大肠杆菌表达菌株Bl21(DE3)plus中可溶性表达且表达量较高。其氨基酸序列为SEQ.ID.NO:1所示。通过全基因合成将嗜热蛋白RTCB全长基因克隆到带有His标签的pET28表达载体上，将重组载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)plus中，37℃振荡培养至OD600nm值0.8左右时加入终浓度为0.5mM的IPTG进行诱导表达，表达条件为：20℃振荡培养16h。将构建的重组表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)plus中进行嗜热蛋白RTCB的可溶性表达。以50µg/ml卡那霉素和34µg/ml氯霉素为选择压力，转接重组表达菌株于含有上述选择压力的LB液体培养基中，37℃，220rpm振荡培养至OD600nm值0.8左右，加入终浓度为0.5mM的IPTG进行诱导表达，20℃，200rpm振荡培养16至20小时，6000rpm离心15min收菌。将离心收集的表达菌以适量缓冲液（50mMTrispH8.0，500mMNaCl，5%甘油，10mM咪唑，2mMB-ME，0.2mMPMSF）悬菌，使用低温超高压细胞破碎仪（广州聚能生物科技有限公司）裂解菌体，以18000rpm高速离心30min去除沉淀和其它颗粒状杂质，收集上清于70℃加热处理20min后以18000rpm高速离心30min。将离心后上清液与Ni-NTA亲和介质结合后，用50mMTrispH8.0，500mMNaCl，5%甘油，50mM咪唑，2mMB-ME的缓冲液冲洗介质，去除杂蛋白。最终用50mMTrispH8.0，500mMNaCl，5%甘油，250mM咪唑，2mMB-ME的洗脱液将目的蛋白从亲和介质上洗脱下来，以30KDa截留的浓缩管将洗脱液浓缩。将浓缩后的蛋白溶液进一步用Superdex20016/600柱进行凝胶过滤层析纯化，使用的缓冲液为20mMTrispH7.4，100mMNaCl，2mMDTT。将洗脱下来的目的蛋白进行浓缩至浓度为15-30mg/ml，分装后于-80℃保存，用于功能实验。实施例2.嗜热蛋白RTCB的RNA连接功能检测-温度适应性及时间依赖性实验中本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种嗜热菌RNA连接酶RTCB在低温催化RNA连接和DNA环化中的应用，其特征在于，在70℃~37℃温度条件下，嗜热RTCB用于完成RNA连接反应，用于完成RNA环化的激活反应，以及用于完成DNA环化激活反应。
【技术特征摘要】
1.一种嗜热菌RNA连接酶RTCB在低温催化RNA连接和DNA环化中的应用，其特征在于，在70℃~37℃温度条件下，嗜热RTCB用于完成RNA连接反应，用于完成RNA环化的激活反应，以及用于完成DNA环化激活反应。2.根据权利...
【专利技术属性】
技术研发人员：李继喜，段树燕，陈子珺，李正阳，纪锐，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：上海,31
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