玉米锌指结合蛋白互作因子基因Actin及其重组表达载体和应用制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及玉米锌指结合蛋白互作因子基因Actin及其重组表达载体和应用。该基因全长12712bp，为一个完整的表达框，有6个外显子构成，编码123个氨基酸，通过酵母中的表达检测，发现Zm‑Actin基因能与Zm‑ZnRing基因具有明显的相互调控作用，且两基因共定位在叶绿体中发挥作用。本发明专利技术公开的Actin基因具有提高外源基因翻译效率的功能，该锌指结合蛋白是具有E3泛素连接酶活性的，E3泛素连接酶参与植物盐胁迫响应过程中，控制膜运输及产生活性氧来调控细胞的生长代谢，该基因可应用于提高烟草叶片中活性氧的增加以调节细胞的生长代谢。

【技术实现步骤摘要】
玉米锌指结合蛋白互作因子基因Actin及其重组表达载体和应用
本专利技术属于生物
，具体涉及玉米锌指结合蛋白互作因子基因Actin及其重组表达载体和应用。
技术介绍
很多RING型锌指蛋白蛋白质泛素化途径中催化终末过程的E3泛素化连接酶都含有RING结构域，这些RING型锌指蛋白主要是通过和其他蛋白质之间的相互作用，参与泛素化蛋白降解过泛素化蛋白降解过程会改变蛋白活性，影响生物效应，RING型锌指蛋白可能参与很多重要生物效应。RING型锌指蛋白基因也和盐胁迫息息相关。锌指结合蛋白也是具有E3泛素连接酶活性的，参与植物盐胁迫响应过程中，主要调控膜运输相关基因表达量，控制膜运输及产生活性氧来调控参与盐胁迫途径的。但RING型锌指蛋白研究主要集中在水稻与拟南芥中，在大豆、玉米等其他作物中研究较少，且与之互作的基因验证较少，在其应用上的研究更是少之又少，因此，将玉米锌指蛋白与基因Actin同时注射到烟草中发现两基因的互作位点在膜和胞质中，并测定活性氧的含量，进而发现两基因参与到膜运输中。植物基因互作后的信号传递激活了包括活性氧(AOS:activeoxidespecies)的生成和其它各类防卫反应。活性氧迸发(oxidativeburst)被认为是过敏反应(HR:hypersensitiveresponse)的特征性反应，也是植物对病原物应答的最早期反应之一。AOS作为与植物抗病性密切相关的因子，一直是人们关注的焦点。AOS主要由病原菌诱导产生,其中非亲和病菌诱导的AOS迸发强烈且持续时间长。植物在处于一些逆境(stress)条件下，(例如：低温、紫外光)，也能产生AOS。植物体内主要的AOS是：超氧阴离子(O2-)、过氧化氢(H2O2)、羟自由基(OH-)。它们之间可以相互转变，其中OH-极为活泼，能与有机化合物作用产生自由基链反应，氧化细胞质膜成分，使酶失活、核酸降解，从而导致细胞损坏，组织坏死，产生过敏反应。AOS具有抗微生物活性，能作为过氧化物酶的底物使细胞壁交联，强化细胞壁，参与过敏反应，与植保素生成有关，并作为信号分子参与诱导基因表达，使植物获得局部和系统抗性。植物具有完整的体系来调节活性氧的生成和积累，确保有效信号传导，这样既可使植物能抑制病菌的感染和再度侵入，又能使自身少受氧化胁迫。其清除AOS的体系主要是依靠超氧歧化酶(SOD:surperoxidedismutase)、过氧化氢酶(CAT:catalase)、过氧化物酶(POX:peroxidase)。另外植物体内两种极重要的抗氧化物抗坏血酸(ASA:ascorbicacid)、还原型谷胱甘肽(GSH)也参与AOS清除。AOS是目前关于植物抗病性研究的的热点，但由于AOS含量少、不稳定，造成了含量测定和组织定位困难，不同的组织部位往往需要不同的方法检测，而国内鲜见关于AOS检测方法研究的报道。
技术实现思路
基于现有技术存在的缺陷，本专利技术的目的在于验证玉米锌指结合蛋白与Actin基因表达蛋白相互作用，并将互作位点在烟草叶片内进行定位，解决了两基因互作位点的精确定位。本专利技术的另一专利技术目的在于提供了含有玉米锌指结合蛋白基因与基因Actin的重组载体，能够高效表达玉米锌指蛋白基因；本专利技术的第三个目的在于提供玉米锌指结合蛋白与Actin基因表达蛋白互作条件下的的应用。为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：（权利要求）玉米锌指蛋白基因和Actin基因的两个蛋白之间互作，所述玉米锌指结合蛋白核苷酸序列如SEQIDNO：1所示；所述Actin基因核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。含有上述所述玉米锌指结合蛋白基因与基因Actin得重组表达载体。一种重组细胞，含有上述的重组载体。上述的玉米锌指结合蛋白与基因Actin表达蛋白相互作用调控膜运输基因表达量，在提高植物叶片活性氧中的应用。优选地，所述植物为烟草。有益效果本专利技术从玉米中克隆玉米锌指结合蛋白基Zm-ZnRing（GRMZM2G035341）和基因ActinZm-Actin（GRMZM2G152328），Zm-ZnRing基因全长12712bp，为一个完整的表达框，有6个外显子构成，编码123个氨基酸，Zm-Actin基因全长2531bp，为一个完整的表达框，有4个外显子构成，编码377个氨基酸，分别将两个基因序列构建到重组的表达载体，通过在烟草和酵母中的表达检测，发现Actin能显著提高报告基因Zm-ZnRing的表达安水平；因此本专利技术公开的Zm-Actin具有提高外源基因翻译效率的功能，该锌指结合蛋白基因Zm-ZnRing是具有E3泛素连接酶活性的，E3泛素连接酶参与植物盐胁迫响应过程中，主要调控膜运输相关基因表达量，控制膜运输及产生活性氧来调控细胞的生长代谢，该基因可应用于提高烟草叶片中活性氧的增加。附图说明图1：Zm-ZnRing凝胶电泳图图2：Zm-Actin凝胶电泳图图3：酵母双杂和双分子荧光互补实验验证图图4：互作组与对照组的活性氧含量比较图。图5：不同时间下活性氧浓度测定。具体实施方式下面结合附图，对专利技术的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1酵母双杂：1．酵母重组载体构建将锌指蛋白基因（GRMZM2G035341）和Actin基因（GRMZM2G152328）的基因全长在基因的起始位点（ATG）设计引物引入KpnI酶切位点，在3’末端引入PacI酶切位点，分别用PCR方法扩增出基因的全长cDNA，基因扩增使用的引物序列为：2328-FKpnI：CGGGGTACCATGGCCGATGCCGAGGATAT2328-RPacI；CCTTAATTAACGATGGATGGGCCGGACTCG5341-FKpnI：CGGGGTACCATGTCCGCCATGGAGACCGA5341-RPacI：CCTTAATTAACTAGTGGCCATATTTCTGGAACT将得到的扩增产物进行胶回收，测定浓度。载体和目的基因必须采用相同的酶切位点，然后用KpnI和PacI双酶切目的基因片段和载体，重新回收后。使用NEB的T4连接酶分别连入pGADT7和pGBKT7克隆载体，连接体系如下：CompotentVolume(μL)ddH2O9pGADT7/pGBKT7载体2ZmNAC77基因片段4T4连接酶15xT4buffer4将上述反应液置于PCR仪16℃反应过夜，即可得到重组载体，用于酵母转化。2．酵母感受态的制备（1）20mlYPDA接种Y2Hgold单菌落，250rpm，30℃，摇菌16h；（2）50mlYPDA，接种约1ml，同时留1ml空白YPD使OD600调至0.2-0.3，置于30℃，250rpm振荡培养5h至OD600为0.5～0.6（大约108细胞/ml）；（3）将菌液移至50ml无菌离心管中，1500rpm室温离心5min收获细胞，加入10ml无菌水重悬，1200rpm室温离心2min，弃上清；（4）再加入10ml无菌水重悬，1200rpm室温离心2min，弃上清；（5）加入1ml无菌水重悬，并转移至无菌的1.5mL离心管中,12000rpm室温离心1min,弃上清；（6本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.玉米锌指蛋白基因和Actin基因的两个蛋白之间互作，其特征在于，所述玉米锌指结合蛋白核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述Actin基因核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

【技术特征摘要】
1.玉米锌指蛋白基因和Actin基因的两个蛋白之间互作，其特征在于，所述玉米锌指结合蛋白核苷酸序列如SEQIDNO：1所示；所述Actin基因核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。2.含有权利要求1所述玉米锌指结合蛋白基因与基因Actin的...

【专利技术属性】
技术研发人员：李慧，何林林，朱建堂，裴腊明，高幸幸，
申请(专利权)人：济南大学，
类型：发明
国别省市：山东,37