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一种脱细胞神经支架及其制备方法技术

技术编号:21411881 阅读:47 留言:0更新日期:2019-06-22 07:18
本发明专利技术涉及一种脱细胞神经支架的制备方法,包括以下步骤:取离体神经组织进行预处理;将经过预处理的所述离体神经组织进行反复冻融;对所述离体神经进行低渗处理;对所述离体神经用含有去垢剂的溶液处理脱除细胞并用核酸酶处理,清洗后得到脱细胞神经支架。通过使用本发明专利技术方法,在最大程度保留神经基膜管和神经基质结构的同时,充分去除脂质、蛋白质和核酸等抗原性成分。

A kind of acellular nerve scaffold and its preparation method

The invention relates to a preparation method of acellular nerve scaffold, which comprises the following steps: taking the isolated nerve tissue for pretreatment; freezing and thawing the preconditioned isolated nerve tissue repeatedly; hypoosmotic treatment of the isolated nerve; treating the isolated nerve with a solution containing a detergent and removing the cells with nuclease, and obtaining the acellular nerve after cleaning. Bracket. By using the method of the invention, antigenic components such as lipid, protein and nucleic acid are fully removed while preserving the structure of nerve basement membrane tube and nerve matrix to the greatest extent.

【技术实现步骤摘要】
一种脱细胞神经支架及其制备方法
本专利技术涉及组织工程材料领域,具体地,涉及一种制备脱细胞神经支架的方法以及该方法制备的的脱细胞神经支架。
技术介绍
临床上因各种原因造成的神经损伤非常常见,当缺损较大(>3cm)时,通常难以进行无张力吻合,需要进行神经移植。其中,自体神经移植虽然有肯定的疗效,且作为其他治疗方法对比的金标准,但存在来源有限及伦理问题等局限性,限制了其进一步使用。然而,目前的工艺技术水平还无法仿制出类似天然细胞外基质结构和功能的人工支架,而去细胞同种异体神经内部天然结构与受区神经的细胞外基质结构相似,同时具有免疫原性弱、去细胞完全、神经基底膜管保存好、有利于轴突趋化性再生等优点,得到专家一致认可。因此,脱细胞神经支架成为了组织工程支架理想选择。近年来组织工程学和再生医学的大量研究表明,细胞外基质(Extraellularmatrix,ECM)是细胞新陈代谢场所,可诱导调节细胞的生长、繁殖与分化,其自身的形态和功能与组织的形态和功能有着密切的关系。细胞外基质在哺乳动物的发育和生理活动中起重要的作用,基质中的很多成分,如胶原的氨基酸序列在种属间高度保守,这种同源性也为异种细胞外基质作为生物活性支架莫定了基础。研究表明,神经组织内ECM成分有重要的生物学功能,不仅能够明显的引导和促进神经再生,同时为神经再生提供良好的微环境。天然神经细胞外基质成分主要包含层粘连蛋白(Laminin,LN)、纤维粘连蛋白(Fibronectin,FN)、I型胶原(TypeIcollagen)、IV型胶原(TypeIVco11agen)、硫酸肝素蛋白多糖(Heparinsulfateproteoglycan,HSPG)等大分子物质。层粘连蛋白是一种多机能蛋白,由A链和B1链与B2链共同构成十字架型结构,对轴突再生和生长方向起到关键作用。人硫酸乙酰肝素链与大量的细胞表面蛋白结合,促进生长因子-受体的相互作用。Carbonetto等认为I型胶原也能促进神经轴突再生。ECM中还含有多种神经营养因子如神经生长因子(Nervegrowthfactor,NGF)、睫状源性神经营养因子(Ciliaryneurotrophicfactor,CNTF)、胶原细胞源性神经营养因子(Glialcellline-derivedneurotrophicfactor,GDNF)、脑源性神经营养因子(Brain-derivedneurotrophicfactor,BDNF)等都有不同程度的营养活性。因此,脱细胞异体神经支架材料修复效果就支架本身特点而言,主要取决于神经天然结构保存的完整性和免疫原性物质的去除程度。通过冻干、冷冻、冻融、乙醇处理、放射辐照、振荡等物理方法处理异体神经,均可降低其抗原性。然而,这些单一的方法都存在不同程度的抗原成分去除不充分、神经三维网状结构破坏的问题,神经再生效果欠佳。目前较为认可化学萃取法有Sondell法和Hudson法。Sondell法运用萃取剂TritonX-100和脱氧胆酸钠萃取神经组织,该方法不仅在动物实验中取得了成功,而且在临床应用中也取得了较好的疗效。Hudson法运用萃取剂TritonX-200、SB-10和SB-16萃取小动物体神经,脱细胞及去髓鞘效果上较Sondell法更为显著,但在大型哺乳动物及人源性神经萃取方面未见有进一步的报道,因此本专利技术是基于对Hudson法的改良,使其适宜运用于粗大神经的萃取。组织脱细胞的化学萃取剂主要有4种类型:(1)阴离子型,如TritonX-200,脱氧胆酸钠;(2)阳离子型;(3)非离子型,如TritonX-100;(4)两性型,如SB-10,SB-16。上述类型的萃取剂各有利弊,因此需要综合考虑来决定采用何种萃取剂。Hudson法中采用阴离子型萃取剂TritonX-200及两性型萃取剂SB-10、SB-16,在粗大神经脱细胞过程中主要存在脱髓鞘不彻底,关于此点,经过前期研究讨论,我们认为可能跟以下原因有关:1、粗大神经板层状髓鞘结构相对于小动物神经更厚、更致密;2、上述萃取剂属性温和,破坏作用较弱。因此,对于粗大神经,需要一种新的去细胞方法用于处理离体神经组织,制备出理想的、有利于神经再生的组织工程神经支架。
技术实现思路
本专利技术为解决以上问题提供了一种脱细胞神经支架的制备方法。本专利技术解决上述技术问题的技术方案如下:一种脱细胞神经支架的制备方法,包括以下步骤:S1.取离体神经组织进行预处理,所述神经组织优选为粗大神经组织;S2.将经过预处理的所述离体神经组织进行反复冻融;S3.将步骤S2处理后的所述离体神经组织进行低渗处理;S4.脱细胞:将步骤S3处理后的所述离体神经组织用含有去垢剂的溶液处理脱除细胞,并用PBS缓冲液清洗;S5.核酸酶处理:用含DNA酶和RNA酶的混合溶液处理脱除细胞后残留的核酸成分,并用PBS缓冲液清洗,得到脱细胞神经支架。在上述技术方案的基础上,本专利技术还可以做如下改进。进一步,所述预处理包括剔除神经外血管、脂肪及结缔组织。进一步,所述步骤S2通过以下方式实现:将经过预处理的所述离体神经组织置于液氮中1~3min,25~37℃放置3~10min,重复操作3~4次。进一步,所述步骤S3通过以下方式实现:将步骤S2处理后的所述离体神经组织在25~37℃下浸渍于低渗液中3~6h,所述低渗液优选为无菌蒸馏水。进一步,S4包括以下步骤:S41.将步骤S3处理后的所述离体神经组织置于含有SB-10的溶液中,在20~25℃、以80~100次/分钟的频率震荡浸泡12~18h;S42.将S41处理后的所述离体神经组织置于含有TritonX-200和SB-16的混合液中,在20~25℃,以80~100次/分钟的频率震荡浸泡9~12h,然后用灭菌的PBS缓冲液清洗;S43.将S42处理后的所述离体神经组织置于含有SB-10的等渗液Ⅰ中,在10~15℃下,以80~100次/分钟的频率震荡浸泡6~9h,然后用灭菌的PBS缓冲液清洗;S44.将S43处理后的离体神经组织置于含有TritonX-200和SB-16的等渗液Ⅱ中,在10~15℃下,以80~100次/分钟的频率震荡浸泡9~12h,然后用灭菌的PBS缓冲液清洗;完成S44后,再依次进行一次S43和S44的处理。进一步,所述等渗液Ⅰ还含有95~105mmol/L乳糖钾盐、20~30mmol/L磷酸二氢钾、3~8mmol/L硫酸镁、3~8mmol/L腺苷、25~35mmol/L棉糖、2~6mmol/L谷胱甘肽、0.2~0.4U/L胰岛素、50~100mg/L青霉素、0.2~0.5mg/L地塞米松、0.5~1.5mmol/L别嘌呤醇、45~55g/L羟乙基淀粉。进一步,所述等渗液Ⅱ还含有95~105mmol/L乳糖钾盐、20~30mmol/L磷酸二氢钾、3~8mmol/L硫酸镁、3~8mmol/L腺苷、25~35mmol/L棉糖、2~6mmol/L谷胱甘肽、0.2~0.4U/L胰岛素、50~100mg/L青霉素、0.2~0.5mg/L地塞米松、0.5~1.5mmol/L别嘌呤醇、45~55g/L羟乙基淀粉。进一步,步骤S41和S43中,SB-10的工作浓度为125mmo1/L,步骤S42和S44中Tri本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种脱细胞神经支架的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:S1.取离体神经组织进行预处理;S2.将经过预处理的所述离体神经组织进行反复冻融;S3.将步骤S2处理后的所述离体神经组织进行低渗处理;S4.脱细胞:将步骤S3处理后的所述离体神经组织用含有去垢剂的溶液处理脱除细胞,并用PBS缓冲液清洗;S5.核酸酶处理:用含DNA酶和RNA酶的混合溶液处理脱除细胞后残留的核酸成分,并用PBS缓冲液清洗,得到脱细胞神经支架。

【技术特征摘要】
1.一种脱细胞神经支架的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:S1.取离体神经组织进行预处理;S2.将经过预处理的所述离体神经组织进行反复冻融;S3.将步骤S2处理后的所述离体神经组织进行低渗处理;S4.脱细胞:将步骤S3处理后的所述离体神经组织用含有去垢剂的溶液处理脱除细胞,并用PBS缓冲液清洗;S5.核酸酶处理:用含DNA酶和RNA酶的混合溶液处理脱除细胞后残留的核酸成分,并用PBS缓冲液清洗,得到脱细胞神经支架。2.根据权利要求1所述的一种脱细胞神经支架的制备方法,其特征在于,所述预处理包括剔除神经外血管、脂肪及结缔组织。3.根据权利要求1所述的一种脱细胞神经支架的制备方法,其特征在于,步骤S2通过以下方式实现:将经过预处理的所述离体神经组织置于液氮中1~3min,25~37℃放置3~10min,重复操作3~4次。4.根据权利要求1所述的一种脱细胞神经支架的制备方法,其特征在于,步骤S3通过以下方式实现:将步骤S2处理后的所述离体神经组织在25~37℃下浸渍于低渗液中3~6h。5.根据权利要求1所述的一种脱细胞神经支架的制备方法,其特征在于,S4包括以下步骤:S41.将步骤S3处理后的所述离体神经组织置于含有SB-10的溶液中,在20~25℃、以80~100次/分钟的频率震荡浸泡12~18h;S42.将S41处理后的所述离体神经组织置于含有TritonX-200和SB-16的混合液中,在20~25℃,以80~100次/分钟的频率震荡浸泡9~12h,然后用灭菌的PBS缓冲液清洗;S43.将S42处理后的所述离体神经组织置于含有SB-10的等渗液Ⅰ中,在10~15℃下,以80~100次/分钟的频率震荡浸泡6~9h,然后用灭菌的PBS缓冲液清洗;S44.将S43处理后的离体神经组织置于含有Trito...

【专利技术属性】
技术研发人员:王伟李杰马义勇智晓东李宇张玉强张振宇管树军邱裕佳段思腾张臣鸣曹宇
申请(专利权)人:王伟锦州医科大学
类型:发明
国别省市:辽宁,21

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