光镜-透射电镜联用样品处理试剂及CLEM检测方法技术

本发明专利技术提供一种光镜‐透射电镜联用样品处理试剂，包括固定剂、包埋剂：亲水性碱性树脂GMA、硼氢化钠、细胞核荧光染料和透射电镜染料，并利用提供的光镜‐透射电镜联用样品处理试剂进行CLEM检测的方法，通过样品固定、去除背景荧光、样品脱水、渗透、包埋、聚合、超薄切片、激光共聚焦显微镜成像、透射电镜图像获取以及后期图像处理完成。本发明专利技术解决了现有方法难以兼容荧光信号和样品细胞结构的保存的问题，样品具有较强的荧光信号并能同时保留完好的超微结构信息，采用图像归一方法简单有效，可方便的将已有的荧光显微镜与透射电镜联用，以获得高一致性的光镜‐电镜联用图像，本发明专利技术结合了目标分子的定位信息及超微结构信息，非常实用。

Sample Treatment Reagent and CLEM Detection Method by LM-TEM

The invention provides a sample treatment reagent for light microscopy and transmission electron microscopy, including fixing agent and embedding agent: hydrophilic alkaline resin GMA, sodium borohydride, nuclear fluorescent dye and transmission electron microscopy dye, and a CLEM detection method using the provided sample treatment reagent for light microscopy and transmission electron microscopy, through sample immobilization, background fluorescence removal, sample dehydration, infiltration and embedding. Polymerization, ultra-thin section, laser confocal microscopy imaging, transmission electron microscopy image acquisition and post-image processing. The invention solves the problem that the existing method is not compatible with the preservation of fluorescence signal and sample cell structure. Samples have strong fluorescence signal and can retain intact ultrastructure information at the same time. The image normalization method is simple and effective, and can conveniently combine the existing fluorescence microscope with transmission electron microscope to obtain a highly consistent image of the combination of light and electron microscopy. The information of target molecule location and ultrastructure is very practical.

【技术实现步骤摘要】
光镜-透射电镜联用样品处理试剂及CLEM检测方法
本专利技术属于检测
，具体涉及一种光镜-透射电镜联用样品处理试剂及利用该试剂进行CLEM检测的方法。
技术介绍
了解目标细胞、细胞器的精确结构信息、以及目标蛋白在细胞内的定位及对结构的影响，可以为研究生长、发育、生殖、学习记忆、信号转导、免疫反应、新陈代谢等生命活动提供必要的信息。单独应用荧光显微技术无法获得样品的结构信息，而研究蛋白质的精确定位的免疫胶体金标记电镜技术受限于抗原决定簇难以保存、抗体难以进入树脂而标记成功率低，非特异性背景高等问题，难以被广泛使用而日渐被可同时展现目标细胞、蛋白的荧光信号与细胞内丰富的结构信息光镜-电镜联用(CorrelativeLight-andElectronMicroscopy，CLEM)技术所取代。光镜-电镜联用技术方案是先在荧光显微观察体系下获取荧光信号定位信息，之后对样本进行电子着色，转移至电子显微镜体系观察，再根据荧光-电镜定位参照体系提供的位置信息，使用图像处理软件将荧光与图像与电子显微镜图像对应重合，同时获得目标细胞、细胞器或蛋白的定位和超微结构信息。光镜-电镜联用技术方案中，包埋后荧光观察的方法先对样品进行固定、脱水、渗透、包埋处理，再对完全一致的样品观察荧光信号、电镜图像，具有更高的一致性，可获得较精确的结果，但一方面样品制备技术难以兼容荧光信号和样品细胞结构的保存，包埋后样品信号获得时的超薄片层荧光信号非常弱，结构信息亦不理想；另一方面整合的光镜-电镜设备尚未普及。怎样在包埋后的样品上同时保留良好的荧光信号并维持好的超微结构，并建立便捷稳定的图像归一方法以利用已有荧光显微镜及电子显微镜成为急需解决的问题。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种光镜-透射电镜联用样品处理试剂，包括固定剂：戊二醛、包埋剂、硼氢化钠、细胞核荧光染料和透射电镜染料。进一步地，所述固定剂为2.5％戊二醛或4％多聚甲醛与0.5％戊二醛混合的固定剂，其中优选为2.5％戊二醛。2.5％戊二醛作为固定剂，样品细胞超微结构保留效果最好。所述包埋剂为亲水性碱性树脂GMA；进一步地，所述细胞核荧光染料为吖啶橙(AcridineOrange，AO)、碘化丙啶(PropidiumIodide，PI)、Diaminophenylindole(DAPI)、Hoechst染料、EthDIII、7-AAD或RedDot2中的一种。进一步地，所述透射电镜染料为醋酸铀和柠檬酸铅。本专利技术的另一个目的是提供利用所述的光镜-透射电镜联用样品处理试剂进行CLEM检测的方法，通过以下步骤实现：(1)样品固定：带荧光蛋白标记的样品以固定剂于4-8℃固定不少于4小时；(2)去除背景荧光：4-8℃下，步骤(1)的样品以0.5％的硼氢化钠的磷酸缓冲盐溶液(PBS)处理不少于5分钟，以去除背景荧光；(3)样品脱水、渗透、包埋、聚合：4-8℃下，样品脱水、-20℃用包埋剂(亲水性碱性树脂GMA)渗透、包埋、聚合；(4)超薄切片：样品经超薄切片机切片，以坐标铜网捞取超薄切片样品，便于初步定位目标荧光信号所在区域；(5)：细胞核荧光染色：以细胞核荧光染料对坐标铜网上的超薄切片样品进行细胞核染色，便于精确定位目标荧光信号在细胞中的位置；(6)激光共聚焦显微镜成像：经荧光观察，在激光共聚焦显微镜下找到目标细胞结构和细胞，记录其所在的坐标铜网格的位置；(7)电子着色：经步骤(5)观察后的位于坐标铜网上的超薄切片样品用透射电镜染料；(8)透射电镜图像获取：以透射电镜低倍寻找到目标区域所在铜网格，以高倍拍摄其超微结构，获得其超微结构；(9)后期图像处理，利用细胞核荧光染料所标记细胞核，与透射电子显微镜下细胞核图像进行重合，同时获得目标荧光信号的定位以及超微结构信息。进一步地，所述的荧光蛋白为增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、增强型黄色荧光蛋白(EYFP)、mVenus荧光蛋白中的一种。其中步骤(1)所述的样品固定是将带荧光蛋白标记的样品以2.5％戊二醛于4-8℃固定不少于4小时。进一步地，所述步骤(3)中样品脱水步骤为分别以50％、70％、95％乙醇于4-8℃脱水处理样品。进一步地，所述步骤(3)中选用亲水性碱性树脂GMA作为包埋剂渗透、包埋、聚合，步骤为以70％、85％、100％GMA依次处理样品；换新的100％GMA后，于-20℃再处理60分钟；换新的100％GMA后，-20℃渗透过夜，再将样品转移至100％GMA中，以低温紫外聚合仪于-20℃聚合不少于72小时。进一步地，所述步骤(4)为以坐标铜网捞取超薄切片样品。进一步地，所述步骤(5)中的细胞核荧光染色为以DAPI水溶液对超薄切片样品的细胞核进行荧光染色。进一步地，所述步骤(7)中电子着色为将激光共聚焦拍摄完毕的带铜网玻片置于清水中，划开封片剂，去除盖玻片，取出铜网，室温以4％醋酸铀染色、Reynolds’柠檬酸铅染色。进一步地，所述步骤(9)的后期图像处理为在Photoshop软件中打开荧光图像和电镜图像，新建图像，其像素高、宽度大于荧光/电镜图像的120％，依次复制粘贴电镜图像、荧光图像，成为不同图层，并进行透明化、形变处理，以细胞核为参照，进行光镜、电镜图像处理归一，同时得到EYFP所标示的荧光信号的定位以及超微结构信息。利用本专利技术提供的光镜-透射电镜联用样品处理试剂进行CLEM检测的方法，解决了现有方法难以兼容荧光信号和样品细胞结构的保存的问题，样品具有较强的荧光信号并能同时保留完好的超微结构信息。图像归一方法简单有效，可方便的将已有的荧光显微镜与透射电镜联用，以获得高一致性的光镜-电镜联用图像，结合了目标分子的定位信息及超微结构信息。附图说明图1是以坐标铜网格在激光共聚焦下获得目标的位置信息；其中a.绿色为EYFP通道，蓝色为DAPI通道，明场下可见目标区域所处坐标铜网格位置；b.白色方框所选的a区域的放大；c.白色方框所选的b区域的放大。图2是透射电镜检测荧光所选定的目标区域的细胞超微结构；其中a.透射电镜下寻找到的与图1同一铜网格；b.白色方框所选的a区域的放大；c.白色方框所选的b区域的放大。图3是光-电联用揭示目标分子的荧光定位及所在区域的超微结构信息。具体实施方式本专利技术结合附图和实施例作进一步的说明。但是，这些实施例并不限制本专利技术的范围。本文提及的所有公开物中的公开内容，包括专利和专利申请说明书，通过引用并入本专利技术，达到明文记载所有这些公开物的程度。实施例所用的材料与方法1.实验试剂人宫颈癌细胞Hela；大肠杆菌菌株DH5α；质粒pAcGFP1-Mito(ClontechCat.No.632432PT3730-5)；质粒pEYFP–N1(ClontechCat.No.6006-1,PT3192-5)；胎牛血清蛋白(FetalBovineSerum，FBS)(HyClone)；培养基RPMI1640(Invitrogen)；Tag酶(生工)；高保真DNA聚合酶pfu(Promega)；T4DNA连接酶(Takara)；限制性内切酶(Takara)；质粒DNA分离纯化试剂盒、DNA胶回收试剂盒(QIAgene)；LipofectAMINETM2000(Invitrogen)；戊二醛(sigma)；多聚甲醛(本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种光镜‑透射电镜联用样品处理试剂，其特征在于，包括固定剂、包埋剂、硼氢化钠、细胞核荧光染料和透射电镜染料。

【技术特征摘要】
1.一种光镜-透射电镜联用样品处理试剂，其特征在于，包括固定剂、包埋剂、硼氢化钠、细胞核荧光染料和透射电镜染料。2.根据权利要求1所述的一种光镜-透射电镜联用样品处理试剂，其特征在于，所述固定剂为2.5％戊二醛或4％多聚甲醛与0.5％戊二醛混合的固定剂；所述包埋剂为亲水性碱性树脂GMA；所述细胞核荧光染料为吖啶橙、溴化乙锭、碘化丙啶、DAPI、Hoechst染料、EthDIII、7-AAD或RedDot2中的一种；所述透射电镜染料为醋酸铀和柠檬酸铅。3.根据权利要求2所述的一种光镜-透射电镜联用样品处理试剂，其特征在于，所述固定剂优选为2.5％戊二醛。4.利用权利要求1所述的光镜-透射电镜联用样品处理试剂进行CLEM检测的方法，其特征在于，通过以下步骤实现：(1)样品固定：带荧光蛋白标记的样品以固定剂于4-8℃固定不少于4小时；(2)去除背景荧光：4-8℃下，步骤(1)的样品以0.5％的硼氢化钠的磷酸缓冲盐溶液处理不少于5分钟，以去除背景荧光；(3)样品脱水、渗透、包埋、聚合：4-8℃下，样品脱水、-20℃用包埋剂渗透、包埋、聚合；(4)超薄切片：样品经超薄切片机切片，以坐标铜网捞取超薄切片样品；(5)细胞核荧光染色：以细胞核荧光染料对坐标铜网上的超薄切片进行细胞核染色；(6)激光共聚焦显微镜成像：经荧光观察，在激光共聚焦显微镜下找到目标细胞结构和细胞，记录其所在的坐标铜网格的位置；(7)电子着色：经步骤(5)观察后的位于坐标铜网上的超薄切片样品以透射电镜染料染色；(8)透射电镜图像获取：以透射电镜低倍寻找到目标区域所在铜网格，以高倍拍摄其超微结构，获得其超微结构；(9)后期图像处理，利用细胞核荧光染料所标记细胞核，与透射电子显微镜下细胞核图像进...

【专利技术属性】
技术研发人员：王贝贝，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33