用于定量监测山核桃干腐病侵染和传播的qLAMP方法及所用引物技术

本发明专利技术公开了一种用于监测山核桃干腐病病菌孢子数量动态的定量环介导等温扩增引物，q‑LAMP引物组合物由以下4条引物组成：上游外引物(F3)、下游外引物(B3)、上游内引物(FIP)、下游内引物(FIB)。本发明专利技术还同时提供了包含上述q‑LAMP引物组合物的定量环介导等温扩增试剂盒，以及提供了利用该试剂盒进行的山核桃干腐病病菌孢子数量动态的定量环介导等温扩增方法，从而获得孢子数量、DNA浓度。采用本发明专利技术的方法能定量监测雨水、树体和土壤等处的山核桃干腐病菌孢子数量。

QLAMP method and primers for quantitative monitoring of infection and transmission of dry rot disease of Hickory

The invention discloses a quantitative RING-mediated isothermal amplification primer for monitoring spore number dynamics of Carya Carya dry rot fungus. The Q LAMP primer composition consists of four primers: upstream external primer (F3), downstream external primer (B3), upstream internal primer (FIP) and downstream internal primer (FIB). The present invention also provides a quantitative loop-mediated isothermal amplification kit containing the above Q LAMP primer composition, and a quantitative loop-mediated isothermal amplification method for the spore number dynamics of Carya dry rot fungus using the kit, thereby obtaining the spore number and DNA concentration. The method of the invention can quantitatively monitor the spore number of dry rot fungus of hickory in rainwater, tree body and soil, etc.

【技术实现步骤摘要】
用于定量监测山核桃干腐病侵染和传播的qLAMP方法及所用引物
本专利技术属于生物技术与植物病害流行学领域，涉及定量环介导等温扩增(qLAMP)技术用于监测雨水、树体和土壤等处山核桃干腐病病菌孢子数量的定量环介导等温扩增引物组及其使用方法，属于植物病害流行学、动态监测及预警的

技术介绍
茶藨子葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)是寄主依赖型弱寄生性植物病原真菌，寄主范围很广，是一种世界范围内危害木本植物健康的真菌病原，其中侵染山核桃树干引起山核桃干腐病。山核桃干腐病在浙西等山核桃主产区普遍发生，受害面积逐步扩大，是山核桃产业发展的瓶颈。病原菌以菌丝体在山核桃树体内越冬，翌年春季潜伏在树体内的病菌开始活动，突破树皮形成溃疡斑，其表面形成子实体并释放孢子，引起新的侵染。孢子借风雨传播，侵入树皮细胞或树体伤口后表现明显的“潜伏侵染”特性，从3月下旬开始到11月都有不同程度的病害发生。4月中旬至6月中旬气温在25℃—30℃是孢子释放侵染的高峰期的高峰，7～8月气温30℃以上的高温天气不利于病菌的发展，秋季气温下降至30℃以下又会产生病菌的发展。目前急需一种快速，准确监测雨水、树体等处山核桃干腐病病菌孢子数量的技术，以达到对干腐病的传播与发生做出科学合理的预测预报的目的。随着核酸相关的鉴定方法不断发展，基于普通PCR的方法已经成功用于检测山核桃干腐病菌，但PCR法特异性等检测耗时偏长，需要6～8h，且检测灵敏度偏低，检测过程较繁杂，关键的是还容易受到各种PCR抑制物的影响。环介导等温扩增技术(Loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)是日本荣研株式会社专利技术的一种新的核酸扩增技术，因为其扩操作简便、快速、特异性高、成本低等优点，成为可以替代PCR的新的核酸扩增技术。它是针对靶基因的6个区域设计4对特异性引物，在Bst大片段聚合酶的作用下引起自循环链置换反应，60-65℃范围60min内，能大量合成目标DNA。由于LAMP扩增过程依赖识别靶序列6个独立区域，所以反应特异性很强，并且核酸扩增过程是在恒温条件下进行，普通水浴锅或者等温保温瓶就能满足反应要求，检测成本降低，所需时间短。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种用于监测雨水、树体等处山核桃干腐病菌孢子数量的定量环介导等温扩增(q-LAMP)方法、引物组合物和试剂盒。为了解决上述技术问题，本专利技术提供用于监测山核桃干腐病病菌孢子数量动态的定量环介导等温扩增引物，q-LAMP引物组合物由以下4条引物组成(即，由上下游外引物，上下游内引物这四条引物组成)：上游外引物(F3)：5’—TGTCCATAGGTTCACCTCCA—3’；下游外引物(B3)：5’—AGATGGTCTGCCTGTGGT—3’；上游内引物(FIP)：5’—CAAAGTCAGCGCGATGCAGCGACCGGCCAATGCGTAAG—3’；下游内引物(FIB)：5’—AGGGTAACCAAATCGGTGCTGCGTCGATTCGCGTTAGCGG—3’。本专利技术还同时提供了用于监测山核桃干腐病病菌孢子数量动态的定量环介导等温扩增试剂盒，包含上述q-LAMP引物组合物。作为本专利技术的试剂盒的改进：正/反内向引物FIP/BIP的浓度为1.6μM，正/反向外引物F3/B3的浓度为0.125μM。作为本专利技术的试剂盒的进一步改进：试剂盒还包含定量环介导等温扩增反应预混液：10×ThermoPolBuffer、dNTPs(1mM)、MgCl2(6.25mM)、甜菜碱(0.6M)、10×SYBRGreenI、BstDNA聚合酶(0.4U·μL-1)、ddH2O。本专利技术还同时提供了利用上述试剂盒进行的山核桃干腐病病菌孢子数量动态的定量环介导等温扩增方法：1)、q-LAMP反应q-LAMP反应体系(20μL)：10×ThermoPolBuffer2.0μL、10mM的dNTPs2.0μL、25mM的MgCl25.0μL、5M的甜菜碱2.4μL、10×SYBRGreenI1.2μL、8U/μL的BstDNA聚合酶1μL，20μM的FIP引物1.6μL、20μM的BIP引物1.6μL、10μM的F3引物0.25μL、10μM的B3引物0.25μL、DNA模板1μL，ddH2O补足至20μL；扩增条件为恒温65.9℃，1min(此时间点获取荧光数据，这一过程为一个循环)，进行80个循环；80℃反应10min，终止反应；注：可获得CT值；即，20μL检测反应体系由上述19μL检测溶液和1μL待测DNA模板(浓度在0.001ng/μL～100ng/μL)组成。2)、获得孢子数量、DNA浓度。作为本专利技术的定量环介导等温扩增方法的改进：孢子数量(个)计算公式为DNA浓度计算公式为y为CT值。在本专利技术中，稀释样品CT值(y)与每毫升样品孢子数量的Log值(x)之间的标准曲线1：y＝-6.863x+49.937，孢子数量(个)计算公式为计算公式：构建标准曲线，用每毫升样品孢子数量的Log值为x轴、对应的CT值为y轴作图，显示递减线性等式[y＝mx+b,或y＝m(log每毫升样品孢子数量)+b],从递减的线性等式可以推导出如下等式，以确定未知样本的量：标准曲线2：定义lg(DNA浓度值/0.0001)为x，对应的CT值为y轴作图，即：y＝-3.5823x+37.233，DNA浓度计算公式为在本专利技术中，扩增结果的分析和判定方法包括：在扩增前加入SYBRGreenI作为反应指示剂，以荧光信号做为结果判定依据，反应结束后仪器自动根据标准曲线显示定量结果CT值。根据q-LAMP扩增反应时间与梯度稀释山核桃干腐病菌孢子制成标准曲线，再根据待测样品的反应时间，可准确算出该样品的孢子起始浓度。本专利技术的方法能定量监测雨水、树体和土壤等处的山核桃干腐病菌孢子数量，克服以往实时荧光定量PCR检测方法的不足，具有高灵敏度、高特异性、低污染、反应稳定等优点，该方法不易受PCR抑制物及其它污染物的影响。本专利技术的专利技术过程包括：(1)根据从山核桃干腐病菌扩增得到的β-tubulin序列与其菌他菌种间的β-tubulin序列差异位点设计特异性引物；(2)引物的筛选；(3)引物的特异性检测；(4)q-LAMP反应温度优化；(5)q-LAMP的检测灵敏度。具体如下：1、引物的设计：首先基于赤霉β-tubulin序列比对出2个同源性较高的序列，设计了1对葡萄座腔菌引物A1(干Aβ-F1816和干Aβ-R)，从GenBank中下载拟盘多毛孢菌(Pestalotiopsismicrospora，登录号为KU377338.1)、木霉菌(Trichodermaviride，登录号为Z15055.1)、层生镰刀菌(Fusariumproliferatum，登录号为KJ544178.1)、黑孢菌(Nigrosporachinensis，登录号为KY019579.1)、轮层炭菌(Daldiniasp.，登录号为KU684130.1)、链格孢菌(Alternariaoregonensis，登录号为JQ671993.1)的β-tubulin序列，根据山核桃干腐病菌扩增得到的β-tubulin序列与其菌他菌种间的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于监测山核桃干腐病病菌孢子数量动态的定量环介导等温扩增引物，其特征在于：q‑LAMP引物组合物由以下4条引物组成：上游外引物(F3)：5’—TGTCCATAGGTTCACCTCCA—3’；下游外引物(B3)：5’—AGATGGTCTGCCTGTGGT—3’；上游内引物(FIP)：5’—CAAAGTCAGCGCGATGCAGCGACCGGCCAATGCGTAAG—3’；下游内引物(FIB)：5’—AGGGTAACCAAATCGGTGCTGCGTCGATTCGCGTTAGCGG—3’。

【技术特征摘要】
1.用于监测山核桃干腐病病菌孢子数量动态的定量环介导等温扩增引物，其特征在于：q-LAMP引物组合物由以下4条引物组成：上游外引物(F3)：5’—TGTCCATAGGTTCACCTCCA—3’；下游外引物(B3)：5’—AGATGGTCTGCCTGTGGT—3’；上游内引物(FIP)：5’—CAAAGTCAGCGCGATGCAGCGACCGGCCAATGCGTAAG—3’；下游内引物(FIB)：5’—AGGGTAACCAAATCGGTGCTGCGTCGATTCGCGTTAGCGG—3’。2.用于监测山核桃干腐病病菌孢子数量动态的定量环介导等温扩增试剂盒，其特征在于：包含如权利要求1所述的q-LAMP引物组合物。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：正/反内向引物FIP/BIP的浓度为1.6μM，正/反向外引物F3/B3的浓度为0.125μM。4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于：试剂盒还包含定量环介导等温扩增反应预混液，所述反应预混液包含10×Therm...

【专利技术属性】
技术研发人员：张传清，王琼伟，刘亚慧，徐炳潮，
申请(专利权)人：浙江农林大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33