基因改造方法技术

本发明专利技术提出了一种基因改造方法。该方法包括：对模式动物体内的未成熟卵母细胞原位显微注射基因改造试剂。利用根据本发明专利技术实施例的基因改造方法，将显微注射的时间提前到卵子还未成熟的时期，并且采用在母体内直接注射的办法，注射后的卵母细胞在母体内自然成熟后，被排出并受精，能在F0代得到几乎所有细胞基因组都被编辑的突变体，在注射的当代胚胎里就能看到和纯合突变体一致的表型，以及稳定表达的转基因图谱，相比现有技术，突变体获得时间缩短为2‑3个月，并且无需进行大规模的筛选工作。

Gene Modification Method

The invention provides a genetic modification method. The method includes: in situ microinjection of gene modification reagent into immature oocytes of model animals. By using the genetic modification method according to the embodiment of the present invention, the time of microinjection is advanced to the immature stage of the egg, and the injected oocyte is injected directly into the mother. After natural maturation in the mother, the injected oocyte is discharged and fertilized. Almost all the mutants whose genome has been edited in the F0 generation can be obtained, which can be seen in the injected embryo. Compared with the existing techniques, the acquisition time of homozygous mutants is reduced to 2 to 3 months without large-scale screening.

【技术实现步骤摘要】
基因改造方法
本专利技术涉及生物
，具体地，本专利技术涉及基因改造方法。
技术介绍
以斑马鱼(Daniorerio)为例，斑马鱼是典型的发育生物学模式生物之一，其卵子在体外进行受精和早期胚胎发育。雌鱼排出未受精的成熟卵子，同时雄鱼排出精子，两者在体外完成受精过程。并且斑马鱼早期胚胎是透明的，便于观察和实验操作。现有胚胎显微注射技术是对在体外成功受精的受精卵进行的显微注射。它是将受精后还未进行有丝分裂的胚胎置于由琼脂凝固而成的带孔注射盘内，用玻璃毛细吸管加热拉制而成的玻璃针在显微镜下进行的注射。注射针固定在持针器上，操作简单方便。注射的物质可以是mRNA，蛋白质，DNA，反义寡核苷酸(Morpholino)，以及其他小分子物质，可短时间内对大量胚胎进行注射(平均每30分钟注射200枚胚胎)。注射完成后，将胚胎从琼脂盘中冲洗下来，置于胚胎专用的培养水中，与28-30℃的培养箱中进行培养。受精后，斑马鱼早期胚胎会进入快速卵裂期，时间间隔大概是：受精到第一次细胞分裂完成是45分钟；随后进行大约十次快速细胞分裂，每次间隔15分钟；然后胚胎的合子基因开始大量激活，胚胎逐步开始原肠运动(Kimmeletal.,1995)。现有显微注射技术受限于早期胚胎的快速分裂，注射操作必须在40分钟内完成，并且注射到胚胎里的试剂无法充分的发挥作用便被快速分裂的细胞稀释掉了；以至于单个细胞内的注射试剂含量快速下降，作用效率降低。在构建CRISPR/Cas9突变体的时候，由于注射到胚胎里的gRNA和Cas9mRNA或者蛋白质被快速分散到各个细胞中，无法保证所有细胞的基因组都被它们编辑，更无法保证生殖细胞内的基因组被编辑，所以通常只能得到F0代的生殖细胞嵌合体；然后需要花费大量的时间和精力进行筛选，最终需要6个月甚至一年的时间才能得到稳定的突变体品系(Changetal.,2013；Hwangetal.,2013；Varshneyetal.,2015)。对于转基因鱼的构建也是类似的情况，Tol2转座酶mRNA和质粒DNA也会在注射后因为胚胎细胞的快速分裂而被稀释，导致转基因插入只发生在部分细胞中，也需要大量的时间和精力进行筛选才能得到稳定的转基因品系(Hamletetal.,2006；Kawakami,2007)。更重要的是，当需要同时敲除几个，甚至几十个功能冗余的基因时；或者得到多重转基因鱼时，胚胎显微注射技术需要花费巨大的时间和精力，有时甚至无法办到。目前，在斑马鱼研究领域，某些母源基因敲除或者敲低是现有的胚胎显微注射无法办到的。在许多物种的早期胚胎发育过程，卵子需要积累大量的母源mRNA和蛋白质，这些物质对早期胚胎发育十分重要。但是当需要研究某些母源基因的功能时，需要敲低或者敲除这些基因，但是许多纯合子突变体是致死的或者不育的，无法得到母源合子突变体；在合子基因激活前的短时间内也无法被注射的Morpolino快速封闭；最终导致敲低某个母源表达的基因时，效率不高，有时甚至是无效的。胚胎的显微注射技术在其他物种中也得到了广泛的应用。例如小鼠(Mice)和非洲爪蟾(Xenopus)，由于小鼠胚胎是体内发育，所以显微注射技术涉及到将供体雌鼠处死取卵或者胚胎，然后将注射后的卵子进行体外受精培养(胚胎则无需体外受精)，最后将存活的胚胎移植到受体雌鼠的子宫等待产出；此操作非常复杂，成功率低并且对技术要求极高。对于非洲爪蟾，卵子显微注射技术也是现将卵子从母体取出，注射然后放入母体继续发育，产出；而胚胎的显微注射也面临和斑马鱼胚胎显微注射一样的问题。上述所有现有技术均是将注射的卵母细胞或者受精卵从母体中取出进行体外培养和显微注射后，再体外受精或者移植到另一母体内继续发育。然而，目前在模式动物中并没有成熟有效的卵母细胞母体原位的显微注射技术。
技术实现思路
本申请是基于专利技术人对以下事实和问题的发现和认识作出的：本申请的专利技术人将注射的时间提前到卵子还未成熟的时期，并且采用在母体内直接注射的办法，专利技术人发现，卵母细胞母体原位显微注射后会激发一系列的应激反应，卵母细胞的成活率会显著下降。本申请的专利技术人经过一系列的注射缓冲液的筛选与尝试，模式动物注射前的驯化以及注射后的恢复条件的摸索，成功克服了未成熟卵母细胞在体内被注射后激发的一些列应激反应，注射后的卵母细胞最终能够在母体内高效地自然存活下来并发育成熟排出受精。本申请的专利技术人以斑马鱼为例，成功实现了卵母细胞的在体注射，卵母细胞从注射到成熟大约的40小时内，对于卵子内基因编辑(例如Cas9突变和转基因)非常的充分。本申请首次实现了未成熟卵母细胞的基因编辑，为母源基因功能研究提供了全新的技术手段。本申请的专利技术人能在F0代就得到几乎所有细胞基因组都被编辑的突变体或转基因鱼；所以专利技术人在注射的当代胚胎里就能看到和纯合突变体一致的表型，以及稳定表达的转基因图谱。对比现有技术，本申请的基因改造的方法将突变体和转基因鱼的获得时间缩短为2-3个月，并且无需进行大规模的筛选工作。基于此，本专利技术提出了一种基因改造方法。根据本专利技术的实施例，所述方法包括：对模式动物体内的未成熟卵母细胞原位显微注射基因改造试剂。利用根据本专利技术实施例的基因改造方法，将原位显微注射的时间提前到卵子还未成熟的时期，并且采用在母体内直接注射的办法，注射后的卵母细胞在母体内自然成熟后，被排出并受精，能在F0代得到几乎所有细胞基因组都被编辑的突变体，在注射的当代胚胎里就能看到和纯合突变体一致的表型，以及稳定表达的转基因图谱，相比现有技术，突变体获得时间缩短为2-3个月，并且无需进行大规模的筛选工作。根据本专利技术的实施例，上述基因改造方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：根据本专利技术的实施例，所述基因改造试剂包括选自gRNA、质粒、mRNA、蛋白质、染料和Morpholino的至少之一。上述小分子物质可更加便利地原位显微注射入卵母细胞内，基因组编辑效率进一步提高。根据本专利技术的实施例，所述模式动物是斑马鱼。斑马鱼早期胚胎是透明的，更加便于观察和实验操作，且斑马鱼卵母细胞从注射到成熟大约需要40小时，这个时间对于卵母细胞内基因编辑(例如Cas9突变和转基因)非常的充分，基因改造成功率进一步提高。根据本专利技术的实施例，所述斑马鱼的年龄是6个月～1年。年龄是6个月～1年的斑马鱼是刚性成熟不久的斑马鱼，斑马鱼的状态好，其未成熟卵母细胞进行显微注射后，卵子的成活率会进一步提高。根据本专利技术的实施例，进行所述原位显微注射处理前，进一步包括：对所述年龄为6个月～1年的斑马鱼进行驯化处理；其中，所述驯化处理是通过如下方式进行的：(1)让所述雌性斑马鱼每周交配一次，以便卵母细胞成熟形成规律的周期；(2)卵母细胞成熟形成规律的周期后，让所述雌性斑马鱼休息两周，以便卵母细胞得到积累。由此，雌鱼及其卵母细胞处于一种良好状态，有利于显微注射操作以及后续的恢复和发育。根据本专利技术的实施例，所述原位显微注射前2-3小时内对所述斑马鱼进行禁食处理。进而避免在对斑马鱼注射前麻醉的过程当中，斑马鱼发生死亡。根据本专利技术的实施例，所述原位显微注射前，将所述斑马鱼进行麻醉处理，并置于湿润的海绵上，所述湿润的海绵是将海绵在含有5.4mMKCl，136.8mMNaCl，4.2mMNaHCO3，0.44本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基因改造方法，其特征在于，包括：对模式动物体内的未成熟卵母细胞原位显微注射基因改造试剂。

【技术特征摘要】
1.一种基因改造方法，其特征在于，包括：对模式动物体内的未成熟卵母细胞原位显微注射基因改造试剂。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基因改造试剂包括选自gRNA、质粒、mRNA、蛋白质、染料和/或Morpholino的至少之一。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述模式动物是斑马鱼。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述斑马鱼的年龄是6个月～1年。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，进行所述原位显微注射处理前，进一步包括：对所述年龄为6个月～1年的斑马鱼进行驯化处理；其中，所述驯化处理是通过如下方式进行的：(1)让所述斑马鱼每周交配一次，以便卵母细胞成熟形成规律的周期；(2)卵母细胞成熟形成规律的周期后，让所述斑马鱼休息两周，以便卵母细胞得到积累。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述原位显微注射前2-3小时内对所述斑马鱼进行禁食处理。7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述原位显微注射前，将所述斑马鱼进行麻醉处理，并置于湿润的海绵上，所述湿润的海绵是将海绵在含有5.4mMKCl，136.8mMNaCl，4.2mMNaHCO3，0.44mMKH2PO4，0.25mMNa2HPO4以及0.5％质量体积比的BSA的溶液中浸润后获得的。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，进行原位显微注射后，进一步包括：将所述斑马鱼进行恢复饲养处理和交配处...

【专利技术属性】
技术研发人员：孟安明，吴小童，沈炜敏，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：北京,11