分泌抗柑橘黄龙病菌单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用制造技术

本发明专利技术公开了一种分泌抗柑橘黄龙病菌单抗杂交瘤细胞株及其单抗的应用。柑橘黄龙病叶脉粗提液为抗原免疫BALB/c小鼠，经细胞融合、筛选、克隆，获得1株能分泌抗柑橘黄龙病菌单抗的杂交瘤细胞株11H9，其保藏号为CGMCC No.17285。该细胞株分泌单抗腹水间接ELISA效价达10

Hybridoma Cell Lines Secreting Monoclonal Antibodies Against Citrus Yellow Dragon Disease and Their Application

The invention discloses a hybridoma cell line secreting monoclonal antibodies against Citrus Yellow Dragon pathogen and the application of the monoclonal antibodies. BALB/c mice were immunized with crude extract of Citrus Yellow Dragon disease vein as antigen. A hybridoma cell line 11H9 secreting monoclonal antibodies against Citrus Yellow Dragon disease was obtained by cell fusion, screening and cloning. Its preservation number was CGMCC No. 17285. The indirect ELISA titer of monoclonal antibody secreted by the cell line reached 10.

【技术实现步骤摘要】
分泌抗柑橘黄龙病菌单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种分泌抗柑橘黄龙病菌单克隆抗体杂交瘤细胞株及其单抗的应用。
技术介绍
20世纪初，柑橘黄龙病已经相继在亚洲、非洲、大洋洲、南美洲和北美洲的50多个国家和地区爆发。我国于1919年在华南地区首次报导了柑橘黄龙病，目前该病陆续在我国广东、江西、海南、广西、福建、浙江、云南、贵州、湖南、重庆等省(自治区或直辖市)发生流行，我国柑橘栽培区均遭受柑橘黄龙病危害，受灾面积已达总面积的80％，产量损失85％。柑橘产业因为黄龙病的大范围爆发而面临着前所未有的危机。柑橘黄龙病是由原核生物薄壁菌门韧皮部杆菌属细菌(CandidatusLiberibactersp.)在柑橘等芸香科果树上引起的系统性、毁灭性病害。在不同的地区和国家曾有不同的名称，如黄枯病、青果病、黄梢病等。柑橘黄龙病的病原属于革兰氏阴性细菌，寄生于筛管细胞，属于植物内生细菌，菌体大小约为350-550nm×600-1500nm,可通过筛孔进行移动，病原具两层外膜,厚约20-25nm。柑橘黄龙病的传播有3种方式，分别是昆虫木虱传播、嫁接传播和苗木交易，其中嫁接传播和病苗的交易是柑橘黄龙病远距离传播的主要途径，染病接穗和病苗是主要载体。昆虫传播媒介有亚洲柑橘木虱(Diaphorinacitri)和非洲柑橘木虱(Triozaerytreae)。目前，对柑橘黄龙病菌的检测和诊断多采用低效率的症状观察、指示植物、电镜观察、PCR等方法进行检测，还没有快速实用、高通量的检测技术和方法。本专利技术以柑橘黄龙病叶脉粗提液作为抗原通过杂交瘤技术制备了1株能分泌抗柑橘黄龙病菌特异性单抗的杂交瘤细胞株，并以分泌的单抗为核心建立检测柑橘黄龙病菌的快速实用、准确、高通量的血清学方法，从而为柑橘黄龙病菌的检测和诊断、流行病学的调查、无菌苗木的获得及科学防控体系的建立提供物质和技术支持。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供一种分泌抗柑橘黄龙病菌单抗的杂交瘤细胞株及其单抗应用。分泌抗柑橘黄龙病菌单抗的杂交瘤细胞株11H9，它能分泌抗柑橘黄龙病菌的特异性单抗，杂交瘤细胞株11H9于2019年1月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.17285。一种所述的杂交瘤细胞株分泌的抗柑橘黄龙病菌单抗，抗柑橘黄龙病菌单抗腹水间接ELISA效价达10-7，抗体类型及亚类为IgG1、kappa轻链，该单抗与柑橘黄龙病病叶中56Kda的黄龙病菌蛋白有特异性免疫反应，利用ACP-ELISA和dot-ELISA方法分析发现，单抗检测黄龙病病叶粗提液的灵敏度分别达到1:20480和1:10240倍稀释。抗柑橘黄龙病菌单抗能与来自中国各个地方的感染柑橘黄龙病病叶粗提液有特异性反应，而不与健康的树叶粗提液反应。抗柑橘黄龙病菌单抗在该病害检测上的应用是以单抗为核心建立的各种免疫学检测方法和免疫学检测试剂盒。本专利技术与现有技术相比具有的有益效果：1)提供的杂交瘤细胞株分泌大量抗柑橘黄龙病菌特异性单克隆抗体，以该单抗为核心建立的ACP-ELISA、dot-ELISA和Tissueblot-ELISA方法能高度特异、准确、灵敏地检测柑橘黄龙病菌；2)以本专利技术制备的单抗为核心建立的ACP-ELISA、dot-ELISA和Tissueblot-ELISA方法能够检测到中国广西、江西、浙江以及重庆等中国各地的柑橘黄龙病病菌；3)利用本专利技术所制备的单克隆抗体及其血清学方法检测柑橘黄龙病菌，不需要昂贵的电子显微镜、PCR仪等设备；3)利用本专利技术所制备的单克隆抗体及其血清学检测技术可有效地用于我国果园柑橘黄龙病病菌的检测和诊断，也可用于柑橘黄龙病的流行病学调查、病原菌基因组功能分析、脱毒苗木生产、抗性育种、科学防控等方面。附图说明图1dot-ELISA方法检测柑橘黄龙病菌的特异性分析；HLB-GX、HLB-JX、HLB-ZJ和HLB-CQ代表感染黄龙病菌的广西、江西、浙江和重庆柑橘病叶样品；HealthycitrusofGX、HealthycitrusofJX、HealthycitrusofZJ和HealthycitrusofCQ分别代表健康的广西、江西、浙江和重庆柑橘叶片样品。图2dot-ELISA方法检测柑橘黄龙病菌的灵敏度分析；图3dot-ELISA(A)和PCR(B)方法果园检测柑橘黄龙病菌代表性结果。M是1kbDNAmarker；a1-7，b1-7，c1-7，d1-7，e1-4是检测样品，e6是感染黄龙病菌的阳性对照，e7是健康的柑橘叶片的阴性对照。生物保藏分泌抗柑橘黄龙病菌单抗的杂交瘤细胞株11H9于2019年1月25日保藏于中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏号为CGMCCNo.17285。具体实施方式分泌抗柑橘黄龙病菌单抗的杂交瘤细胞株11H9于2019年1月25日保藏于中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.17285，它能分泌抗柑橘黄龙病菌的单抗。一种所述的杂交瘤细胞株分泌的抗柑橘黄龙病菌单抗，抗柑橘黄龙病菌单抗腹水间接ELISA效价达10-7，抗体类型及亚类为IgG1、kappa轻链，该单抗与柑橘黄龙病病叶中约56Kda的黄龙病菌蛋白有特异性免疫反应，利用ACP-ELISA和dot-ELISA方法分析发现，单抗检测黄龙病病叶粗提液的灵敏度分别达到1:20480和1:10240倍稀释。抗柑橘黄龙病菌单抗能与来自中国各个地方的感染柑橘黄龙病病叶粗提液有特异性反应，而不与健康的树叶粗提液反应。抗柑橘黄龙病菌单抗在该病害检测上的应用是以单抗为核心建立的各种免疫学检测方法和免疫学检测试剂盒。本专利技术提供的杂交瘤细胞株能大量分泌抗柑橘黄龙病菌单抗，且该细胞株分泌的单抗特异性强、效价高、稳定性好、灵敏度高。以该单抗为核心建立检测柑橘黄龙病菌的高通量的血清学方法可成功应用于果园柑橘黄龙病样品的检测和诊断、脱毒苗木的生产、科学防控提供物质和技术支持。下面结合实施例和附图对本专利技术作进一步说明。一、杂交瘤细胞获得及其单克隆抗体的制备1.免疫原及检测抗原的制备将感染黄龙病菌中国菌株的柑橘叶片粗提液作为免疫原，选取病原菌分布较多的叶脉组织进行研磨，方法如下：称取2g感染柑橘黄龙病的叶片叶脉组织，液氮研磨后用含有适量青霉素和链霉素的2mL生理盐水匀浆，再经4层纱布过滤，取过滤液即粗提液作为免疫原及检测抗原。2.免疫动物用柑橘叶片叶脉组织粗提液免疫8周龄BALB/c雌性小鼠：柑橘叶片粗提液100μL与等体积弗氏完全佐剂混合，充分乳化后经腹部皮下多点注射0.2mL每只，间隔3周，取与一免等量抗原和等体积的弗氏不完全佐剂充分乳化后，第二次腹腔注射0.2mL每只，过3周后用加倍剂量的抗原进行腹腔注射，3d后取脾细胞进行融合。3.细胞融合取上述免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)按6:1的比例在无血清的RPMI-1640(Gibco)培养基中混匀，1500rpm离心5min后去除培养基，含有细胞的离心管在37℃水浴中加入1mL50％PEG(分子量1500)融合剂，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分泌抗柑橘黄龙病菌单抗杂交瘤细胞株11H9，其特征在于能分泌抗柑橘黄龙病菌单抗，所述的杂交瘤细胞株11H9于2019年1月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.17285。

【技术特征摘要】
1.一种分泌抗柑橘黄龙病菌单抗杂交瘤细胞株11H9，其特征在于能分泌抗柑橘黄龙病菌单抗，所述的杂交瘤细胞株11H9于2019年1月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.17285。2.一种如权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌的抗柑橘黄龙病菌单抗，其特征在于该单抗腹水间接ELISA效价达10-7，抗体类型及亚类为IgG1、kappa轻链，与柑橘黄龙病病叶中56Kda的黄龙病菌蛋白有特异性免疫反应，利...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴建祥，周雪平，黄德青，何宛芹，王亚琴，吴佳瑜，谢艳，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33