一种大体积生物样本低温保存的方法技术

技术编号:21379572 阅读:24 留言:0更新日期:2019-06-19 01:55
本发明专利技术属于生物医学领域,公开了一种大体积生物样本低温保存的方法,所述方法具体为生物样本经预处理后添加保护剂然后注入聚四氟乙烯管中冷冻保存,待需要时水浴复温。本发明专利技术所述低温保存的方法成功的实现了低浓度保护剂作用下的大体积生物样本冻存,是一种长期安全、稳定可靠、简单有效的保存生物样本的方法,通过该方法可以获得微结构完整、细胞活力强、生物功能优异的生物样本。

A cryopreservation method for large biological samples

The invention belongs to the field of biomedicine, and discloses a method for cryopreservation of large biological samples, in particular, the biological samples are pretreated, added a protective agent, and then injected into a PTFE tube for cryopreservation, and the water bath is rewarmed when needed. The cryopreservation method of the invention has successfully realized the freezing storage of large biological samples under the action of low concentration protectant, and is a long-term safe, stable, reliable, simple and effective method for preserving biological samples. By this method, biological samples with complete microstructures, strong cell viability and excellent biological functions can be obtained.

【技术实现步骤摘要】
一种大体积生物样本低温保存的方法
本专利技术属于生物医学领域,具体涉及一种大体积生物样本低温保存的方法。
技术介绍
生物材料的低温保存,是指采用特定的方法将生物材料冷却至低温,并长期保存;待需要时,可将生物材料按特定的方法复温至生理温度,且使其仍然保持足够的活性。随着现代生物医学发展,低温保存的作用日益凸显,尤其是对组织、器官等大体积生物样本的冻存具有重大意义。典型的低温保存主要包括五个步骤:添加保护剂、降温、长期保存、复温、去除保护剂。在低温保存过程中,生物材料不可避免会遭受各种损伤,其主要引发因素包括:渗透压的改变、冰晶的生长、降温和复温过程中样品内部的温度梯度、复温过程的反玻璃化和再结晶等。因此,低渗透性保护剂浓度以及快速、均匀的降复温过程是实现生物样品成功保存的重要条件。现有的低温保存诸如血管这样大尺寸生物样品的方案是将样品经处理后放入低温冻存管中,生物样品在冷冻后会蜷缩弯曲,这将对生物样品的结构、力学和生物学特性造成损伤。且现有的保存技术多采用逐步添加保护剂的方法,使用程序化的降温过程,采用恒温水浴中边摇动边被动复温的方式,历时漫长、操作繁琐,这些都严重影响了大体积生物样本的保存效果。由于低温冻存管的宏观尺寸,以及热量从外向内的传导方式,热量传输的速度有限,生物材料样品内部各个位置在降复温过程中的温度差异较大,样品内外温度梯度较大,这将导致较大的热应力产生,易引发断裂和微裂纹。复温速率不够快,会导致严重的反玻璃化和再结晶,从而严重影响保存的效果和存活率;同时,高浓度的冷冻保护剂可能导致不可控的渗透损伤和生化毒性,这对于生物材料来说是致命的。专利技术内容有鉴于此,本专利技术的目的在于针对现有技术中存在的问题,提供一种大体积生物样本低温保存的方法,适合于细胞、细胞水凝胶构建物和微组织等大体积生物样本的长期高效保存。为实现本专利技术的目的,本专利技术采用如下技术方案:一种大体积生物样本低温保存的方法,生物样本经预处理后添加保护剂然后注入聚四氟乙烯管中冷冻保存,待需要时水浴复温。作为优选,在注入聚四氟乙烯管前还添加磁性纳米颗粒,且水浴复温时置于电磁线圈内进行电磁复温。作为优选,所述预处理为样本获取、核-壳结构的干细胞水凝胶构建物和干细胞水凝胶纤维的生成。作为优选,所述生物样本为核-壳结构的干细胞水凝胶构建物和干细胞水凝胶纤维时,所述保护剂包括第一保护剂和第二保护剂,第一保护剂为含1mol/L乙二醇和1mol/L1,2-丙二醇的培养基溶液,第二保护剂为含1mol/L~1.5mol/L乙二醇、1.5mol/L1,2-丙二醇、0.002mol/L葡聚糖和0.75mol/L~1mol/L海藻糖的培养基溶液;所述生物样本为脂肪干细胞时,所述保护剂包括第一保护剂、第二保护剂和第三保护剂,第一保护剂为含1mol/L乙二醇和1mol/L1,2-丙二醇的培养基溶液,第二保护剂为含1.5mol/L乙二醇+1.5mol/L1,2-丙二醇的培养基溶液,第三保护剂为含2mol/L乙二醇、2mol/L1,2-丙二醇、0.5mol/L海藻糖的培养基溶液;所述生物样本为血管组织时,所述保护剂为含2.9mol/L二甲亚砜+2.9mol/L甲酰胺+2.7mol/L乙二醇的器官保存液。作为优选,所述聚四氟乙烯管规格为1.2mm内径×1.6mm外径、2mm内径×2.4mm外径或3mm内径×3.4mm外径。作为优选,所述聚四氟乙烯管均匀缠绕在支架上形成一个单元,若干个单元形成一个容器整体。作为优选,所述冷冻为液氮冷冻;所述水浴温度为37℃。作为优选,所述磁性纳米颗粒为Fe3O4纳米颗粒。作为优选,按g/ml计,所述磁性纳米颗粒与所述保护剂的质量体积比为(0.05-1):100。作为优选,所述电磁线圈内的电流为15A。由上述技术方案可知,本专利技术提供了一种大体积生物样本低温保存的方法,所述方法具体为生物样本经预处理后添加保护剂然后注入聚四氟乙烯管中冷冻保存,待需要时水浴复温。本专利技术所述低温保存的方法成功的实现了低浓度保护剂作用下的大体积生物样本冻存,是一种长期安全、稳定可靠、简单有效的保存生物样本的方法,通过该方法可以获得微结构完整、细胞活力强、生物功能优异的生物样本。与现有低温冻存的方法相比,本专利技术所述方法至少具有如下优点之一:1.本专利技术采用聚四氟乙烯管作为生物样本冻存容器,扩大了样品体积却不损害传热,从而实现了大体积生物样本的冻存。2.本专利技术采用电磁复温,对生物样本具有空间加热效果,再结合恒温水浴,可实现快速均匀复温,从而避免复温过程产生反玻璃化和再结晶,并可有效降低降复温过程引发的热应力等因素造成的机械损伤,提高了生物样本冻存的存活率。3.在上述优点的共同作用下,可以有效的抑制降、复温过程中的反玻璃化和再结晶,从而降低了低温保护剂的使用浓度,避免了渗透损伤和生化毒性,提高了生物样本冻存的存活率。4.不同的聚四氟乙烯管单元内可以注入不同种类和浓度的生物样本,结合不同种类和浓度的磁性纳米颗粒,可以实现在同一电磁场下同时进行不同种类的生物样本的冻存与复温,易于实现自动控制和集成。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1:细胞、核-壳结构的干细胞水凝胶构建物、干细胞水凝胶纤维和小型组织;图2:纳米颗粒介导的生物样品电磁加热原理;图3:聚四氟乙烯管与支架单元组成的冷冻容器;图4:冷冻容器整体在电磁线圈中的复温;各图中1为干细胞;2为水凝胶;3为血管组织;4为纳米颗粒;5为磁感线;6为聚四氟乙烯管;7为支架(有机玻璃);8为聚四氟乙烯管与支架构成一个单元;9为冷冻容器整体;10为250ml烧杯;11为电磁加热线圈。具体实施方式本专利技术公开了一种大体积生物样本冻存及复温的方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本专利技术。本专利技术的方法及产品已经通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本
技术实现思路
、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本专利技术技术。为实现本专利技术的目的,本专利技术采用如下技术方案:一种大体积生物样本低温保存的方法,生物样本经预处理后添加保护剂然后注入聚四氟乙烯管中冷冻保存,待需要时水浴复温。本专利技术所述低温保存的方法有别于常规的低温冻存管、冻存袋等冷冻容器,选用聚四氟乙烯管作为冻存容器,充分利用其优良的柔韧性、延展性和生物相容性等特性,在不改变生物样本特征尺寸的前提下对其进行了“微元化”,在保证传热效果的同时,扩大了样品的冻存体积,以达到冻存大体积生物样本的目标。根据生物样本的具体种类选择适当尺寸的聚四氟乙烯管对生物样本进行冻存。在一些实施方案中,所述生物样本为脂肪干细胞、核-壳结构的干细胞水凝胶构建物,所述聚四氟乙烯管规格为1.2mm内径×1.6mm外径。在一些实施方案中,所述生物样本为干细胞水凝胶纤维,所述聚四氟乙烯管规格为2mm内径×2.4mm外径。在一些实施方案中,所述生物样本为血管组织,所述聚四氟乙烯管规格为3mm内径×3.4mm外径。本专利技术所述低温保存的方法中,所述聚四氟乙烯管可以均匀缠绕在支架上形成一个单元,若干个单本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种大体积生物样本低温保存的方法,生物样本经预处理后添加保护剂然后注入聚四氟乙烯管中冷冻保存,待需要时水浴复温。

【技术特征摘要】
1.一种大体积生物样本低温保存的方法,生物样本经预处理后添加保护剂然后注入聚四氟乙烯管中冷冻保存,待需要时水浴复温。2.根据权利要求1所述的方法,在注入聚四氟乙烯管前还添加磁性纳米颗粒,且水浴复温时置于电磁线圈内进行电磁复温。3.根据权利要求1或2所述的方法,所述预处理为样本获取、核-壳结构的干细胞水凝胶构建物或干细胞水凝胶纤维的生成。4.根据权利要求1或2所述的方法,所述生物样本为核-壳结构的干细胞水凝胶构建物和干细胞水凝胶纤维时,所述保护剂包括第一保护剂和第二保护剂,第一保护剂为含1mol/L乙二醇和1mol/L1,2-丙二醇的培养基溶液,第二保护剂为含1mol/L~1.5mol/L乙二醇、1.5mol/L1,2-丙二醇、0.002mol/L葡聚糖和0.75mol/L~1mol/L海藻糖的培养基溶液;所述生物样本为脂肪干细胞时,所述保护剂包括第一保护剂、第二保护剂和第三保护剂,第一保护剂为含1mol/L乙二醇和1mol/L1,2-丙二醇的培养基溶液,第二...

【专利技术属性】
技术研发人员:赵刚陈中嵘程跃曹媛马超白雪飞
申请(专利权)人:中国科学技术大学
类型:发明
国别省市:安徽,34

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