检测褐牙鲆卵壳前体蛋白的免疫荧光试剂盒及应用制造技术

检测褐牙鲆卵壳前体蛋白的免疫荧光试剂盒及应用。通过原核表达的方法制备褐牙鲆卵壳前体蛋白，免疫小鼠开发褐牙鲆卵壳前体蛋白多克隆抗体，并将FITC标记到纯化的多克隆抗体上；由标记了FITC的褐牙鲆卵壳前体蛋白多克隆抗体构建检测褐牙鲆卵壳前体蛋白的免疫荧光试剂盒。本发明专利技术不仅可用于检测褐牙鲆鱼体中卵壳前体蛋白的产生，还可以对卵壳前体蛋白在肝脏组织中的部位进行定位。与之前的免疫组化相比，本发明专利技术步骤较少，节约时间，检测本底值底，为海洋环境雌激素的筛选、检测和生态环境风险评价提供重要工具。

【技术实现步骤摘要】
检测褐牙鲆卵壳前体蛋白的免疫荧光试剂盒及应用
本专利技术属于环境检测领域，具体涉及一种检测褐牙鲆卵壳前体蛋白的免疫荧光试剂盒及应用。
技术介绍
环境雌激素作为一类外源性化合物进入机体后，具有干扰体内正常分泌物质的合成、释放、运转、代谢、结合等过程，激活或抑制内分泌系统功能，从而破坏其维持机体稳定性和调控作用。近年来，环境中雌激素污染对自然环境的生态平衡及人类的健康构成了潜在的威胁,环境雌激素物质进入人体后，女性多出现子宫肌瘤、卵巢癌等疾病，男性多出现睾丸癌、精子的数量与质量下降等症状。低于1ng/L的雌炔醇能导致雄性魟鳟产生雌鱼特有的卵黄原蛋白，而4ng/L的雌炔醇可导致幼鱼的性畸形，其第二性征发生改变。海洋环境雌激素可导致鱼类种群生存力和渔业资源下降。海洋环境雌激素污染日益严重，其中我国近岸海水中雌二醇、雌炔醇、双酚A等常见雌激素的浓度达到45.7ng/L、3.99ng/L、3920ng/L。因此，为解决我国近海海域环境雌激素活性的检测，亟需建立更灵敏、准确、简便的检测技术。卵壳前体蛋白是近年来新发现的一种环境雌激素生物标志物，是一种雌性特异性蛋白，通常在雄鱼和幼鱼体内并不存在，但是在环境雌激素的诱导下能合成和分泌卵壳前体蛋白。通过检测雄鱼或幼鱼体内的卵壳前体蛋白含量可以评价水体环境中的雌激素活性。与目前常用的环境雌激素生物标志物卵黄原蛋白相比，卵壳前体蛋白能更加敏感快速地对环境雌激素做出响应。1ng/LE2就能显著上调雄性海洋青鳉(Oryziasjavanicus)的肝脏卵壳前体蛋白基因表达水平，并且其相对表达量要明显高于卵黄原蛋白的基因表达水平。因此，卵壳前体蛋白是环境雌激素筛选的更加敏感的生物标志物，然而目前国内外均未建立卵壳前体蛋白的检测试剂盒，主要原因在于传统的分离纯化方法难以从鱼体获得卵壳前体蛋白，无法为免疫检测技术的开发提供高纯度的抗原，导致至今尚未建立卵壳前体蛋白的检测方法，并且缺乏能对卵壳前体蛋白产生部位定位定量检测的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种检测褐牙鲆卵壳前体蛋白免疫荧光试剂盒及其制备方法，以满足现有技术的上述要求。检测褐牙鲆卵壳前体蛋白免疫荧光试剂盒，其特征在于该试剂盒装有荧光素（FITC）标记的褐牙鲆卵壳前体蛋白1支。上述检测褐牙鲆卵壳前体蛋白免疫荧光试剂盒中，所述的FITC标记的褐牙鲆卵壳前体蛋白多克隆抗体是以如下方法制备：1)制备褐牙鲆卵壳前体蛋白纯品；2)利用步骤1)得到的褐牙鲆卵壳前体蛋白纯品制备褐牙鲆卵壳前体蛋白多克隆抗体；3)利用步骤2)得到的卵壳前体蛋白多克隆抗体制备FITC标记的卵壳前体蛋白多克隆抗体；具体如下：(1)通过肌肉注射17β-雌二醇诱导褐牙鲆肝脏大量转录ChgHmRNA，用Trizol提取肝脏总RNA，经反转录获得cDNA，以反转后的cDNA为模版，利用引物F:CACCCAAGTTTTCAAGTCTCAGCAGTC，R:CCGCTTACTGAGCAGGGTCAATGAAT进行PCR扩增，回收目的片段；用T4连接酶将目的片段与pClone007载体连接后，将连接产物转化至DH5α感受态细胞中，并进行测序，将测序正确的进行扩大培养，抽提质粒，以上述引物进行PCR扩增，切胶回收目的片段；将回收的目的片段与pDE1表达载体连接后，将连接产物转化至表达宿主菌BL21(DE3)；并将正确表达的宿主菌扩大培养，即加入终浓度为0.1mM的IPTG，置于37℃恒温摇床里震荡培养10小时，将培养好的菌液5000rpm离心20min，收集沉淀，经裂解液处理后，再次离心收集包涵体，向包涵体中加入30mL溶解液(100mMTris，500mMNaCl，10mM咪唑，8M尿素，pH8.0)，4℃搅拌过夜；将溶解后的包涵体10000rpm离心30min，收集上清并过0.45μm滤膜，采用镍离子螯合磁珠纯化，即获得褐牙鲆卵壳前体蛋白纯品；(2)利用得到的褐牙鲆卵壳前体蛋白纯品免疫小鼠：将70µg的卵壳前体蛋白纯品和等体积的弗式完全佐剂乳化后注射入小鼠腹腔，两周后用同样剂量的卵壳前体蛋白纯品与弗氏不完全佐剂充分乳化后对Balb/c小鼠进行加强免疫，一周后尾静脉注射卵壳前体蛋白纯品进行加强免疫，三天后取小鼠的血清，利用ProteinG亲和层析柱从腹水上清中纯化获得免疫球蛋白IgG；纯化的抗体经PBS缓冲液透析24h，即获得褐牙鲆卵壳前体蛋白多克隆抗体；(3)将浓度为1mg/mL纯化的褐牙鲆卵壳前体蛋白多克隆抗体置于交联反应液(7.56gNaHCO3，1.06gNa2CO3，7.36gNaCl，1LddH2O)中4℃透析过夜；按抗体：FITC=6：1的比例，称取FITC，缓慢加入抗体溶液中以将FITC标记至抗体；边加边轻轻晃动使其与抗体混合均匀，暗处4℃反应8h；用半饱和的硫酸铵将标记后的抗体沉淀分离，以除去未结合的荧光素，将交联物在PBS中透析至透析液清亮，即获得FITC标记的褐牙鲆卵壳前体蛋白多克隆抗体。上述检测褐牙鲆卵壳前体蛋白免疫荧光试剂盒在海洋环境雌激素污染调查中的应用。本专利技术的优点本专利技术采用的免疫荧光组织化学检测技术是以抗体为基础，具有灵敏快捷，特异性高等特点，适用于对卵壳前体蛋白的定位定量检测的技术。因此，本专利技术采用原核表达技术制备重组卵壳前体蛋白，制备高灵敏度的抗体，将FITC标记到纯化的抗体上，建立卵壳前体蛋白的免疫检测技术，开发能够检测海洋雌激素活性的试剂盒。另一方面，褐牙鲆隶属于鲽形目，牙鲆科，牙鲆属，是肉食性底栖鱼类，其发育过程中有变态过程。褐牙鲆主要分布于中国的黄渤海、东海以及朝鲜、日本沿岸水域。目前在中国、韩国、日本沿海均有养殖，是重要的海水增养殖鱼种。因此在海洋环境污染日趋严重的情况下，有必要把鲆鲽类作为海洋污染物对海洋鱼类污染研究的实验模型，于是本专利技术利用褐牙鲆的卵壳前体蛋白作为生物标志物对环境雌激素进行检测。本专利技术为进一步提高对微量水平雌激素活性的检测敏感度和特异性，以一种稳定的卵壳前体蛋白为抗原，以及其多克隆抗体，首次建立了褐牙鲆卵壳前体蛋白的免疫荧光检测方法，并且利用原核表达技术实现卵壳前体蛋白的大量制备，以期海洋环境雌激素的灵敏检测提供业务化工具。此外，本专利技术的免疫荧光技术中涉及的抗体标记技术相比之前的抗体技术，无需复杂的设备，更适合低剂量的抗体标记；本专利技术的免疫荧光组织化学技术相比常规的免疫组化技术步骤更为简便，节省时间，具有更低的本底值。同时本专利技术的免疫荧光组织化学技术相比酶联免疫吸附技术能更直观的观察到卵壳前体蛋白在肝脏组织中的分布。附图说明图1为本专利技术的免疫荧光试剂盒对雄性褐牙鲆肝脏组织的检测结果。图2为本专利技术的免疫荧光试剂盒对经10ng/L乙炔雌二醇暴露后雄性褐牙鲆肝脏组织检测结果。图3为本专利技术的免疫荧光试剂盒对经50ng/L乙炔雌二醇暴露后雄性褐牙鲆肝脏组织检测结果。具体实施方式：一种检测褐牙鲆卵壳前体蛋白免疫荧光试剂盒，其特征在于该试剂盒装有FITC标记的鼠抗褐牙鲆卵壳前体蛋白多克隆抗体1支。制备检测褐牙卵壳前体蛋白的免疫荧光检测技术包括以下步骤：（一）制备褐牙鲆卵壳前体蛋白纯品；（二）制备褐牙鲆卵壳前体蛋白多克隆抗体；（三）制备FITC标记的褐牙鲆卵壳前体蛋白多克隆抗体；其中，所述（一）制备褐牙鲆卵壳前体本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测褐牙鲆卵壳前体蛋白的免疫荧光试剂盒，其特征在于该试剂盒装有FITC标记的褐牙鲆卵壳前体蛋白多克隆抗体1支。

【技术特征摘要】
1.一种检测褐牙鲆卵壳前体蛋白的免疫荧光试剂盒，其特征在于该试剂盒装有FITC标记的褐牙鲆卵壳前体蛋白多克隆抗体1支。2.根据权利要求1所述的检测褐牙鲆卵壳前体蛋白的免疫荧光试剂盒，其特征在于所述的FITC标记的褐牙鲆卵壳前体蛋白多克隆抗体是用以下方法制备：(1)通过肌肉注射17β-雌二醇诱导褐牙鲆肝脏大量转录ChgHmRNA，用Trizol提取肝脏总RNA，经反转录获得cDNA，以反转后的cDNA为模版，利用引物F:CACCCAAGTTTTCAAGTCTCAGCAGTC，R:CCGCTTACTGAGCAGGGTCAATGAAT进行PCR扩增，回收目的片段；用T4连接酶将目的片段与pClone007载体连接后，将连接产物转化至DH5α感受态细胞中，并进行测序，将测序正确的进行扩大培养，抽提质粒，以上述引物进行PCR扩增，切胶回收目的片段；将回收的目的片段与pDE1表达载体连接后，将连接产物转化至表达宿主菌BL21(DE3)；并将正确表达的宿主菌扩大培养，即加入终浓度为0.1mM的IPTG，置于37℃恒温摇床里震荡培养10小时，将培养好的菌液5000rpm离心20min，收集沉淀，经裂解液处理后，再次离心收集包涵体，向包涵体中加入30mL溶解液(100mMTris，500mMNaCl，10mM咪唑，8M尿素，pH8...

【专利技术属性】
技术研发人员：王军，张振忠，汝少国，王蔚，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：山东,37