基于化学衍生化与HPLC-MS的不饱和脂肪酸定量方法技术

技术编号:21375864 阅读:41 留言:0更新日期:2019-06-15 12:43
本发明专利技术公开了一种基于化学衍生化与HPLC‑MS的不饱和脂肪酸定量方法1)以直接质谱分析确定脂肪酸的标准优化锥电压和碰撞能量电压;2)以不饱和脂肪酸A作为内标,将内标和标准品脂肪酸进行碳碳双键环氧化,并通过HPLC‑ESI‑MS方法进行检测,建立标准品脂肪酸与内标的标准曲线;3)将待测脂肪酸进行碳碳双键环氧化;4)将环氧化的待测脂肪酸以内标法,通过HPLC‑ESI‑MS方法进行检测,检测待测脂肪酸的含量,并在步骤1)所得的标准曲线上进行回归,得到待测脂肪酸的含量。本发明专利技术对脂肪酸的异构体进行准确的定量检测,并且简化了定量的流程,提高了定量检测的准确性。

【技术实现步骤摘要】
基于化学衍生化与HPLC-MS的不饱和脂肪酸定量方法
本专利技术涉及液质联用
,特别是涉及一种用于利用脂肪酸环氧化衍生物来进行定性定量检测的液质联用方法。
技术介绍
脂肪酸是中性脂肪、磷脂和糖脂的主要成分。在有充足氧供给的情况下,脂肪酸可氧化分解为CO2和H2O,并释放大量能量,因此脂肪酸是机体主要能量来源之一1。脂肪酸在人体中通常以酯化形式存在,作为中性脂、磷脂和糖脂等脂质的组分。酯化脂肪酸在磷脂酶的作用下水解得到游离脂肪酸(freefattyacids,FFA),游离脂肪酸为非酯化的脂肪酸,是类脂代谢物的重要组成部分。一方面,外源性的脂肪通过血浆转运,以游离脂肪酸的形式进入脂肪细胞,再合成脂肪储存,同时机体内的内源性脂肪主要在肝脏中合成,也通过血浆转运而进入脂肪细胞储存;另一方面,储存的脂肪不断降解,以游离脂肪酸的形式进入各组织被氧化利用,使脂肪代谢处于动态平衡。研究表明,游离脂肪酸与糖、脂代谢异常2及其他心血管病,如肥胖、高血压、高胰岛素血症、Ⅱ型糖尿病等关系密切3-4。同时,由于结构的差别,脂肪酸的种类繁多,不同结构的脂肪酸在生物体的生命活动中起到的意义也不尽相同5。短链脂肪酸由于易挥发,所以在生物体中以及食物中积累的含量较少,其最大的功能是提供能量,如丁酸(C4H8O2),其还有调节免疫应答和炎症反应,同时具有抑制肿瘤生长,促进细胞分化和凋亡的作用6。长链脂肪酸则是生物体中累积的脂肪酸的主要组成成分,碳链长短不同,其性质也有差异7,研究中发现膳食中月桂酸(C12H24O2)和肉豆蔻酸(C14H28O2)可以增加血清中胆固醇含量,棕榈酸(C16H32O2)则能降低血清中胆固醇的含量8。同时由于饱和脂肪酸以及不同饱和度的不饱和脂肪酸在生物体中承担的生命意义也有所不同9-10,关于多不饱和脂肪酸ω-6PUFA和ω-3PUFA的研究表明,多不饱和脂肪酸对脑、视网膜和神经组织发育有影响。此外,ω-3PUFA对肿瘤有较好的抑制作用。Spencer等11的研究表明,ω-3PUFA能够抑制肿瘤新生血管的形成,其作用机制可能与血管内皮生长因子有关。而ω-6PUFA却会促进癌细胞的转运,促进癌症的增殖12。因此,研究ω-3PUFA与ω-6PUFA在人体组织中的比例关系,对癌症的研究具有极其重要的意义。自第一台质谱仪被研发出以后,质谱技术经过百年的发展在不断完善,现在质谱检测技术已经发展成为了较完整的体系,覆盖多种分析物的检测,以及广阔的应用领域。在当今的研究中,脂质组学、蛋白质组学等生命科学领域都是研究的热点,而随着质谱技术快速发展且其具有灵敏度高,样品用量少,分析速度快,分离和鉴定可以同时进行等优点,已广泛的被应用于化学、生物学、药学等生命科学相关领域。质谱技术的发展在很大程度上推动了脂质组学的发展,尤其是软电离质谱为脂质组学的研究提供了强有力的技术支持。在软电离的条件下脂肪酸分子可以在不发生断裂的情况下,根据脂质在正负离子模式下带电的特点来对不同类的脂质进行分析,也可以对脂肪酸进行二级质谱分析,根据碎片信息得到脂肪酸的结构信息。常用于脂肪酸定性和定量分析的软电离质谱技术有电喷雾电离(electrosprayionization,ESI)13和基质辅助激光解吸电离(matrix-assistedlaserdesorptionionization,MALDI)14。在Ma等15-17的研究中,Paternò-Büchi反应(P-B反应)也被用于对不饱和脂肪酸中的双键的快速化学衍生化。在紫外灯照射下,衍生试剂丙酮与脂质分子的碳碳双键发生P-B反应生成四元氧杂环丁烷结构15-16,MS检测到与丙酮的加成产物M+58的分子离子峰,对其进行MS/MS分析。在碰撞诱导解离条件下四元环结构裂解,生成一对分子量相差26Da的特征离子峰,通过该特征碎片峰的归属即可鉴定双键位置。该法成功实现了脂肪酸和磷脂的双键位置快速鉴定,衍生反应速度快,并可实现在线反应。然而,由于异构/同量异位干扰以及副反应的限制,该方法的光谱复杂度较高,因此在分析上受到影响。而利用直接质谱进样法分析衍生化后脂肪酸双键位置来区分脂肪酸异构体也普遍存在很多问题,当处理复杂的混合样品时,过多的脂肪酸种类导致碎片峰十分复杂,其衍生化后产物的一级质谱中同分子量产物峰的出现也极大的干扰了对应脂肪酸的结构分析。因此引入样品前处理的方法对脂质样品进行分离是必要的。液相色谱(LC)通常与质谱联用进行检测,是一种常用的脂质分析方法。脂质样品可以先经过液相色谱分离,然后对各梯度分离出的组分进行收集再进一步使用质谱分析,这样可以减少不同种类脂质之间的相互干扰。Orellana-Coca等人18利用高效液相色谱(HPLC)和蒸发光散射检测(ELSD)开发了更快速和描述性的物质分析程序。而传统的脂肪酸环氧化方法未能使脂肪酸进行充分的环氧化,环氧化后产物变得较为复杂,影响了液质联用检测技术的应用。15-16,19-21酮作为催化剂在过硫酸盐的作用下对脂肪酸的环氧化被证明是十分有效的,而带有六元环结构的酮催化剂可以实现对脂肪酸的充分环氧化,效率显著22-25。综上所述,利用液质联用的检测手段以及与其相匹配的脂肪酸环氧化方法来对脂肪酸进行定性定量检测可以克服直接质谱进样检测中的图谱复杂、分析难度大、定量不准确等缺点,并且易于异构体分析以及准确定量的特点可以应用于临床血浆样本的研究,对比正常与患癌血浆样本来探究脂肪酸双键位置异构对于人体健康,以及探究脂肪酸在肿瘤形成和发展过程中的作用具有十分重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种基于化学衍生化与液相色谱质谱联用的脂肪酸双键定位及定量方法。本专利技术的另一目的在于提供上述方法在分析生理和病理样本(肿瘤)中,寻找脂肪酸种类以及含量差异。本专利技术一个方面提供了一种高效液相-质谱联用的不饱和脂肪酸定量检测方法,其包括以下步骤:1)以直接质谱分析确定脂肪酸的标准优化锥电压和碰撞能量电压;2)以不饱和脂肪酸A作为内标,将内标和标准品脂肪酸进行碳碳双键环氧化,并通过HPLC-ESI-MS方法进行检测,建立标准品脂肪酸与内标的标准曲线;3)将待测脂肪酸进行碳碳双键环氧化;4)将环氧化的待测脂肪酸以内标法,通过HPLC-ESI-MS方法进行检测,检测待测脂肪酸的含量,并在步骤1)所得的标准曲线上进行回归,得到待测脂肪酸的含量。在本专利技术的技术方案中,不饱和脂肪酸A选自人体血浆中不存在或者含量极少的不饱和脂肪酸,优选为十七烯酸,其在人血浆中的浓度可忽略不计,不影响其他不饱和脂肪酸的定性定量检测,因此可以作为人体血浆不饱和脂肪酸检测中的内标。在本专利技术的技术方案中,步骤2)中,标准曲线通过以下方法获得:2-1)在不同浓度的标准品脂肪酸中分别加入内标;2-2)将步骤2-1)所得混合物分别进行碳碳双键环氧化;2-3)以高效液相-质谱联用检测,保持内标浓度不变,根据不同油酸浓度下检测其环氧化产物和内标的环氧化产物的强度比建立标准曲线。在本专利技术的技术方案中,步骤2)中,标准曲线中标准品的浓度为4-6个不同梯度浓度,浓度范围根据不同种类的不饱和脂肪酸的实际浓度有所变化,以油酸为例,其标准曲线中油酸标准品的浓度范围为10-1000μM。在本专利技术的技术方案中,所本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种高效液相‑质谱联用的不饱和脂肪酸定量检测方法,其包括以下步骤:1)以直接质谱分析确定脂肪酸的标准优化锥电压和碰撞能量电压;2)以不饱和脂肪酸A作为内标,将内标和标准品脂肪酸进行碳碳双键环氧化,并通过HPLC‑ESI‑MS方法进行检测,建立标准品脂肪酸与内标的标准曲线;3)将待测脂肪酸进行碳碳双键环氧化;4)将环氧化的待测脂肪酸以内标法,通过HPLC‑ESI‑MS方法进行检测,检测待测脂肪酸的含量,并在步骤1)所得的标准曲线上进行回归,得到待测脂肪酸的含量。

【技术特征摘要】
1.一种高效液相-质谱联用的不饱和脂肪酸定量检测方法,其包括以下步骤:1)以直接质谱分析确定脂肪酸的标准优化锥电压和碰撞能量电压;2)以不饱和脂肪酸A作为内标,将内标和标准品脂肪酸进行碳碳双键环氧化,并通过HPLC-ESI-MS方法进行检测,建立标准品脂肪酸与内标的标准曲线;3)将待测脂肪酸进行碳碳双键环氧化;4)将环氧化的待测脂肪酸以内标法,通过HPLC-ESI-MS方法进行检测,检测待测脂肪酸的含量,并在步骤1)所得的标准曲线上进行回归,得到待测脂肪酸的含量。2.根据权利要求1所述的不饱和脂肪酸定量检测方法,其特征在于,所述的碳碳双键环氧化方法为以单过硫酸氢钾复合盐(Oxone)作为氧化剂,四氢噻喃-4酮1,1-二氧化物作为催化剂进行环氧化反应。3.根据权利要求1-2任一项所述的不饱和脂肪酸定量检测方法,步骤3)为在脂肪酸的有机溶剂中加入过硫酸氢钾和四氢噻喃-4-酮1,1-二氧化物,同时加入EDTA二钠盐溶液,并将pH调节到7-8;在40-80℃下反应至完全,以有机溶剂萃取后干燥有机层,得到环氧化产物。4.根据权利要求1-3任一项所述的不饱和脂肪酸定量检测方...

【专利技术属性】
技术研发人员:蒋宇扬高丹宋超李上富
申请(专利权)人:清华大学深圳研究生院
类型:发明
国别省市:广东,44

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