一种与牙鲆黑化和白化关联的SNP分子标记及其应用制造技术

技术编号:21366649 阅读:22 留言:0更新日期:2019-06-15 10:28
本发明专利技术属于水产养殖鱼类辅助育种技术领域,具体涉及一种与牙鲆黑化和白化关联的SNP分子标记及其应用,SNP分子标记如下:(a)itpr2‑7032‑C/T,位于基因如SEQ ID NO:1所示碱基序列的7032bp位置,碱基T突变成C,异亮氨酸变成缬氨酸,和(b)itpr2‑554‑T/C,位于基因如SEQ ID NO:2所示碱基序列的554bp位置,位于非编码区。本发明专利技术从基因角度出发,筛选到与体色异常相关的SNP位点,并将此位点运用在牙鲆育种工作中,从遗传角度根本性解决牙鲆体色异常的问题。

A SNP Molecular Marker Associated with Blackening and Whitening of Paralichthys olivaceus and Its Application

The invention belongs to the technical field of assisted breeding of aquaculture fish, and specifically relates to a SNP molecular marker associated with blackening and whitening of flounder and its application. The SNP molecular marker is as follows: (a) itpr2 7032 C/T, located at the 70bp position of the base sequence shown in gene SEQ ID NO:1, where the base T mutates into C, isoleucine becomes valine, and (b) itpr2 554 T/C, located in gene such as SEQ. The 554 BP position of the base sequence shown in ID NO:2 is located in the non-coding region. The present invention screens SNP loci related to body color abnormality from the point of view of gene, and applies this locus to the breeding of flounder, so as to fundamentally solve the problem of body color abnormality of flounder from the genetic point of view.

【技术实现步骤摘要】
一种与牙鲆黑化和白化关联的SNP分子标记及其应用
本专利技术属于水产养殖鱼类辅助育种
,涉及SNP分子标记技术,具体涉及一种与牙鲆黑化和白化关联的SNP分子标记及其应用。
技术介绍
自90年代初,鲆鲽类引入我国,随后迅速实现了初级工厂化的普及。鲆鲽类养殖不仅掀起了我国海水养殖第四次发展浪潮。2009年,鲆鲽类鱼种成为我国海水鱼类养殖中产量位居第二位的代表性品种,鲆鲽类养殖创造了巨大的社会财富的同时,为提高人们生活品质作出贡献。牙鲆等比目鱼幼鱼也在孵化场成功地以工业规模生产,但孵化场饲养的牙鲆经常在眼睛侧和盲侧出现体色异常,这个问题降低牙鲆的成活率和市场价格,如何避免牙鲆出现体色异常现象是牙鲆养殖业面临的重大问题。牙鲆的体色异常主要分为白化和黑化两种主要类型,近年来针对牙鲆体色异常的研究很多,也取得了一定进展,但是效果有限,都无法从根本上解决牙鲆体色异常现象,比如,通过早期饲喂富含DHA、维生素A、磷脂的轮虫等浮游动物可以有效的减少牙鲆白化的发生率,但是过量的维生素A会增加无眼侧黑化率;还有研究表明养殖池底沙可以有效减少牙鲆黑化率,很多研究证实营养和养殖环境(背景颜色、密度、光强度、水深、水温)对牙鲆的体色异常影响很大,通过改善养殖环境、营养等因素可以在一定程度上减少牙鲆体色异常率,但都是治标不治本,无法从根本上解决人工养殖牙鲆的体色异常现象。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种与牙鲆黑化和白化关联的SNP分子标记,SNP即单核苷酸多态性,与生物的很多性状如生长速度、抗病性和抗逆性联系密切,从遗传因素出发,通过与牙鲆体色相关的SNP位点对牙鲆亲本的育前排查,建立体色正常的牙鲆家系,从种质上降低牙鲆后代体色异常的发生率,解决现有技术中牙鲆体色异常的问题。本专利技术的上述目的通过以下技术方案实现:本专利技术的与牙鲆黑化和白化关联的SNP分子标记,具体如下:(a)itpr2-7032-C/T,位于基因inositol1,4,5-trisphosphatereceptortype2-like如SEQIDNO:1所示碱基序列的7032bp位置,碱基T突变成C,异亮氨酸变成缬氨酸,正常牙鲆基因型为67.65%TT、14.71%CT和17.63%CC,黑化牙鲆基因型为19.35%CT和80.65%CC,白化牙鲆基因型为12.5%CT和87.5%CC;和(b)itpr2-554-T/C,位于基因inositol1,4,5-trisphosphatereceptortype2-like如SEQIDNO:2所示碱基序列的554bp位置,位于非编码区,正常牙鲆基因型为67.65%TT、14.71%CT和17.63%CC,黑化牙鲆基因型为19.35%CT和80.65%CC,白化牙鲆基因型全部为CC。上述与牙鲆黑化和白化关联的SNP分子标记的筛选方法,包括以下步骤:(ⅰ)分别选择正常牙鲆的正常皮肤、无眼侧体色异常的牙鲆无眼侧正常的白皮肤以及无眼侧体色异常无眼侧的黑皮肤进行基因双向测序,再对测序数据进行SNP分析,初步检测出SNP位点,分析得到在差异表达基因中显著性富集的通路;(ⅱ)在步骤(ⅰ)中与体色相关的通路中进行SNP分析,筛选出位于编码区非同义突变的SNP位点;(ⅲ)对牙鲆在步骤(ⅱ)得到的SNP位点进行分型;(ⅳ)筛选与牙鲆黑化和白化关联的SNP位点。进一步,步骤(ⅰ)中,所述差异表达基因中显著性富集的通路的分析方法包括基因注释、差异基因表达分析、差异基因GO富集分析和差异基因KEGG富集分析。进一步,步骤(ⅲ)中,所述SNP位点分型采用的引物如SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示。进一步,上述与牙鲆黑化和白化关联的SNP分子标记的筛选方法,具体为:(1)采集正常牙鲆的正常皮肤、无眼侧体色异常的牙鲆无眼侧正常的白皮肤以及无眼侧体色异常无眼侧的黑皮肤,提取RNA,并质检;(2)提取的样本RNA进行转录组双向测序,对测序数据进行SNP分析,通过基因注释、差异基因表达分析、差异基因GO富集分析、差异基因KEGG富集分析得到在差异表达基因中显著性富集的通路;(3)在6个与体色相关的通路中(Arachidonicacidmetabolism、Thyroidhormonesynthesis、Phototransduction、Melanogenesi、Retinolmetabolism和PPARsignalingpathway)进行SNP分析,6个通路中存在SNP位点的基因有59个,通过NCBI网站上的Blast软件筛选出位于编码区非同义突变的SNP位点,最后得到12个基因中的22个位于编码区的SNP位点,对这22个SNP位点进行分型;(4)分别采集同一生长环境下的正常牙鲆16尾、黑化牙鲆样本16尾和白化牙鲆样本16尾,提取DNA,针对每一个SNP位点设计引物如SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示,以提取的DNA为模板进行PCR,运用直接测序法对SNP位点进行分型,测序峰图中对应位置仅有C峰,则该个体基因型为CC,若为C和T双峰,则该个体基因型为C/T,若仅有T峰,则该个体基因型为TT,测序结果一方面确定SNP位点基因型外,另一方面对各样本进行序列对比,可能找到新的SNP位点。(5)对采集的16个正常牙鲆样本、16个黑化牙鲆样本和16个白化牙鲆样本的各个SNP位点的基因型进行统计,用SPSS18.0软件对正常牙鲆样本和白化牙鲆样本,正常牙鲆样本和黑化牙鲆样本的基因型统计结果进行单因素方差分析(P<0.05:显著性差异;P<0.01:极显著差异),保留具有显著性差异的SNP位点,最终获得两个SNP位点在正常牙鲆和黑化牙鲆样本中的基因型分布具有极显著差异,即位于基因inositol1,4,5-trisphosphatereceptortype2-like如SEQIDNO:1所示碱基序列的7032bp位置itpr2-7032-C/T、和如SEQIDNO:2所示碱基序列的554bp位置itpr2-554-T/C,其中itpr2-554-T/C是测序序列样本间对比得到的SNP位点,此位点位于非编码区。上述与牙鲆黑化和白化关联的SNP分子标记在降低牙鲆体色异常率的育种方面的应用。进一步,上述SNP分子标记用于降低牙鲆体色异常率育种的具体步骤为:对选做亲本的牙鲆剪取部分鳍条,提取组织DNA,以提取的DNA为模板进行PCR扩增,PCR产物测序,筛选出SNP位点itpr2-7032-C/T为TT纯合、同时位点itpr2-554-T/C也为TT纯合的牙鲆为父本和母本进行人工育种,建立SNP位点itpr2-7032-C/T为TT纯合同时itpr2-554-T/C也为TT纯合的牙鲆家系,其后代为体色异常率较低的苗种。与现有技术相比,本专利技术的有益效果在于:相较于现有改善牙鲆体色异常技术,本专利技术从基因角度出发,筛选到与体色异常相关的SNP位点itpr2-7032-C/T和itpr2-554-T/C,并把此位点运用在牙鲆育种工作中,有望从遗传角度根本性的解决牙鲆体色异常问题。具体实施方式以下结合具体实施方式对本专利技术做进一步详述,以下实施例只是描述性的,不是限定性的,不能以此限定本专利技术的保护范围。与牙鲆黑化和白化关联的SNP分子标记本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种与牙鲆黑化和白化关联的SNP分子标记,其特征在于,所述SNP分子标记如下:(a)itpr2‑7032‑C/T,位于基因如SEQ ID NO:1所示碱基序列的7032bp位置,碱基T突变成C,异亮氨酸变成缬氨酸,正常牙鲆基因型为67.65%TT、14.71%CT和17.63%CC,黑化牙鲆基因型为19.35%CT和80.65%CC,白化牙鲆基因型为12.5%CT和87.5%CC;和(b)itpr2‑554‑T/C,位于基因如SEQ ID NO:2所示碱基序列的554bp位置,位于非编码区,正常牙鲆基因型为67.65%TT、14.71%CT和17.63%CC,黑化牙鲆基因型为19.35%CT和80.65%CC,白化牙鲆基因型全部为CC。

【技术特征摘要】
1.一种与牙鲆黑化和白化关联的SNP分子标记,其特征在于,所述SNP分子标记如下:(a)itpr2-7032-C/T,位于基因如SEQIDNO:1所示碱基序列的7032bp位置,碱基T突变成C,异亮氨酸变成缬氨酸,正常牙鲆基因型为67.65%TT、14.71%CT和17.63%CC,黑化牙鲆基因型为19.35%CT和80.65%CC,白化牙鲆基因型为12.5%CT和87.5%CC;和(b)itpr2-554-T/C,位于基因如SEQIDNO:2所示碱基序列的554bp位置,位于非编码区,正常牙鲆基因型为67.65%TT、14.71%CT和17.63%CC,黑化牙鲆基因型为19.35%CT和80.65%CC,白化牙鲆基因型全部为CC。2.权利要求1所述与牙鲆黑化和白化关联的SNP分子标记的筛选方法,其特征在于,包括以下步骤:(ⅰ)分别选择正常牙鲆的正常皮肤、无眼侧体色异常的牙鲆无眼侧正常的白皮肤以及无眼侧体色异常无眼侧的黑皮肤进行基因双向测序,再对测序数据进行SNP分析,初步检测出SNP位点,分析得到在差异表达基因中显著性富集的通路;(ⅱ)结合步骤(ⅰ)在6个已知的与体色相关的通路中进行SNP分析,筛选出位于编码区非...

【专利技术属性】
技术研发人员:彭康康鲍宝龙龚小玲张博
申请(专利权)人:上海海洋大学
类型:发明
国别省市:上海,31

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