一种高通量筛选转基因纯合植株的装置及方法制造方法及图纸

本发明专利技术公开了一种高通量筛选转基因纯合植株的装置及方法，该装置包括上、下套叠的双层孔板；所述上孔板包括带若干上小孔的上板面以及位于上板面下方且与上小孔连通的若干孔道；所述孔道的孔径由上至下逐渐缩小，孔道用于放置待测植株的种子，且种子恰好卡在孔道的底部开口处；所述下孔板包括带下小孔的下板面以及位于下板面下方且与下小孔连通的用于盛放水或GUS染液的若干凹槽，所述下小孔与上小孔一一对应，所述凹槽供所述孔道插入。本发明专利技术装置通过上、下套叠的双层孔板结构实现了高通量的转基因植株筛选，减少了筛选实验的步骤，缩短了实验时间，能够快速确定上一代转基因纯合植株，以便对转基因纯合植株开展后续研究。

A High Throughput Screening Device and Method for Transgenic Homozygous Plants

The invention discloses a device and method for high-throughput screening of genetically modified homozygous plants, which comprises a double-layer orifice plate with upper and lower nests; the upper orifice plate comprises an upper plate surface with several upper orifices and several channels located below the upper plate surface and connected with the upper orifice; the aperture of the orifice gradually reduces from top to bottom, and the channels are used for placing seeds of the plant to be tested, and the seeds are just right. The lower orifice plate comprises a lower plate surface with a lower hole and a number of grooves connected with the lower plate surface for holding water or GUS dye solution. The lower orifice plate corresponds to the upper orifice one by one, and the groove is inserted into the channel. The device realizes high-throughput screening of transgenic plants through the double-layer pore plate structure of upper and lower nesting, reduces the steps of screening experiments, shortens the experimental time, and can quickly determine the previous generation of transgenic homozygous plants, so as to carry out follow-up research on the transgenic homozygous plants.

【技术实现步骤摘要】
一种高通量筛选转基因纯合植株的装置及方法
本专利技术涉及农业基因工程
，尤其涉及一种高通量筛选转基因纯合植株的装置及方法。
技术介绍
转基因技术是现代农业中常用的一种生物技术手段，能够改良农艺性状，提高农业生产。将转基因技术与常规育种技术紧密结合，能培育多抗、优质、高产、高效的新品种，大大提高品种改良效率，并可降低农药、肥料投入，在缓解资源约束、保障食物安全、保护生态环境等方面潜力巨大。在转基因植株生产过程中，经农杆菌侵染的愈伤组织获得带有目标基因的T-DNA，除了目的基因之外，往往还伴随着报告基因一起转入植物以便于检测是否是转基因阳性植株，例如GUS基因。GUS(β-glucuronidase，β-D-葡萄糖苷酸酶)基因是目前常用的一种报告基因，其表达产物β-葡萄糖苷酸酶是一种水解酶，能催化许多β-葡萄糖苷酯类物质的水解，它可以将5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸酯(X-gluc)分解为蓝色的物质，其检测方法简单、快速、灵敏、稳定，且背景活性低。由于绝大多数植物细胞内不存在内源的GUS活性，所以GUS基因广泛用作转基因植物的报告基因。T0代植株往往都是单拷贝的，T-DNA随机插入任何一条染色体中(如图1)，形成植株Aa(带有T-DNA片段的为A，不带则为a)。那么，只要是阳性的植株，经过GUS染色就会表现出蓝色的特征。之后，伴随而来的是转基因植株的筛选及其对后代中纯合植株的筛选，只有当获得稳定的植株之后才能稳定遗传，便于后续研究。T0代植株所结的种子，即T1代，由于同源染色体中只有一条是携带有目的基因的，因此在后代植株中，根据孟德尔遗传学规律，就会出现分离。Aa的植株后代会出现AA：Aa：aa三种基因型，比例是1:2:1(如图1)。因此，T0代植株并不能马上运用于实验或者农业生产，因为这不是一个稳定的植株。在T1代植株中，AA和Aa并不能通过简单的方法区别出来，两者经GUS染色后都表现出阳性。Aa如果混在其中，那么Aa的后代又会出现aa。只有AA的纯合植株，才能稳定传代(图1)。为了找到T1代中AA植株，需要对T1代植株进行GUS染色，找出阳性植株，也即AA或者Aa，剔除aa。之后，T1代植株所结的种子，即T2代，如果经GUS染色均为蓝色，则可推断T2代所对应的上一代植株为纯合体AA。同时，这些T2代也都是AA基因型，可直接用于繁种。相反，如果T2代植株经GUS染色出现无色(阴性，即aa)植株，那么可以推断其上一代为杂合体Aa。由此可见，获得一个稳定遗传的转基因植株，至少需要种植两代。特别是T2代植株的染色，需要保证多个植株都是GUS蓝色，才能判断其上一代植株为AA纯合植株，筛选工作量巨大。GUS基因所的表达位置有种子中表达和非种子中表达两种。对于在种子中表达的情况而言，现有技术是：将收获的一批后代种子切开进行染色；若染色后的种子均为蓝色，表明结出该批种子的植株为纯合植株。该方法直观，不需要培养幼苗，可直接对种子进行实验；但是，该方法会破坏种子，并且种子中含有淀粉，会使GUS染液浑浊，不利于GUS染液的回收利用。对于在非种子中表达的情况而言，现有技术是：待种子萌发，长至小苗后，移栽到水培液中培养一段时间后，取单株叶片或者根进行染色，再判定上一代植株是否为纯合植株，过程繁琐、筛选工作量大且实验时间长。因此，有必要提供一种高通量筛选转基因纯合植株的装置及方法。
技术实现思路
本专利技术针对于现有技术的不足，提供了一种高通量筛选转基因纯合植株的装置及方法，该装置和方法不仅能够减少筛选实验的步骤，缩短实验时间，而且能够实现高通量的转基因植株筛选，进而快速确定上一代转基因纯合植株，以便对转基因纯合植株开展后续研究。具体技术方案如下：一种高通量筛选转基因纯合植株的装置，包括上、下套叠的双层孔板；所述上孔板包括带若干上小孔的上板面以及位于上板面下方且与上小孔连通的若干孔道；所述孔道的孔径由上至下逐渐缩小，孔道用于放置待测植株的种子，且种子恰好卡在孔道的底部开口处；所述下孔板包括带下小孔的下板面以及位于下板面下方且与下小孔连通的用于盛放水或GUS染液的若干凹槽，所述下小孔与上小孔一一对应，所述凹槽供所述孔道插入。本专利技术装置中的上、下孔板是可拆卸的，并且可以自由组装，当上孔板或下孔板发生损坏时，可以随时拆卸和替换，利于装置的维护。装置中孔道的孔径和凹槽的直径均根据种子的大小而定，保证种子恰好卡在孔道的底部开口处，且孔道可以伸入凹槽内即可。作为优选，所述上板面和下板面均为方形，上小孔和下小孔都分别横纵均匀排布在上板面和下板面上；小孔的均匀排布有利于待测植株种子的分类统计，以降低大批量筛选时出现记录错误的可能性。作为优选，所述上板面上设有用于显示上小孔横纵坐标位置的标识。可以用于标记每一个待测植株的种子，以防待测植株种子过多而造成统计错误。作为优选，所述上板面设有将所有上小孔覆盖住的透气封膜；防止水分和GUS染液的蒸发，利于水分和GUS染液的回收再利用。作为优选，所述孔道的底部开口伸入至凹槽的中部。孔道底部开口位于凹槽的中部既可以保证上孔板的稳固，又可以减少GUS染液的施用量，节约成本。作为优选，所述上孔板为底部开口的96孔PCR板，下孔板为96孔PCR板。将两个PCR板进行套叠可以使孔道恰好卡在凹槽的中部，无需其他支撑物件。作为优选，所述上小孔和下小孔分别在上孔板和下孔板上横纵均匀排布，孔数均为96孔；可以一次性筛选8个株系，每个株系12粒种子。本专利技术还提供了一种高通量筛选转基因纯合植株的方法，包括以下步骤：(1)取所述高通量筛选转基因纯合植株的装置，将待测植株的种子放置在孔道的底部开口处，并向凹槽内倒入清水，使种子浸没于清水中，然后，将所述装置至于30～37℃的环境下进行种子浸种；(2)待种子露白并伸出胚根后，将盛装清水的下孔板替换成盛装GUS染液的下孔板，并使种子的根部浸没于GUS染液中，然后，再将所述装置至于30～37℃的环境下进行染色；(3)若取自某待测植株的所有种子的根部均被染色，判定该植株为转基因纯合植株；若取自某待测植株的部分种子的根部被染色，而另一部分种子的根部未被染色，判定该植株为转基因杂合植株；若取自某待测植株的所有种子的根部均未被染色，判定该植株为非转基因植株。本专利技术中水和GUS染液的加入量视情况而定，以种子完全浸没于水中，萌发后仅根部浸没于GUS染液中为准。由于凹槽内需要盛放水或GUS染液，所以在使用过程中通常需要将上孔板抬起或取下，才能够添加液体至凹槽内。在进行高通量筛选的过程中，需要先加水，后加GUS染液，为了防止GUS染液中含有水分而影响GUS染液的回收利用，可以设置两个下孔板，一个盛装清水，另一个盛装GUS染液，在步骤(2)时，直接将盛装GUS染液的下孔板替换盛装清水的下孔板。作为优选，步骤(2)中，设置两个下孔板，一个盛装清水，另一个盛装GUS染液，待种子露白并伸出胚根后，将盛装清水的下孔板替换成盛装GUS染液的下孔板。上述方法需要保证转基因植株中含有报告基因；进一步地，所述转基因纯合植株或转基因杂合植株中含有的报告基因为GUS基因。而GUS染液是含有5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸(X-Gluc)的缓冲液；其中，5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸(X-Gl本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高通量筛选转基因纯合植株的装置，其特征在于，包括上、下套叠的双层孔板；所述上孔板包括带若干上小孔的上板面以及位于上板面下方且与上小孔连通的若干孔道；所述孔道的孔径由上至下逐渐缩小，孔道用于放置待测植株的种子，且种子恰好卡在孔道的底部开口处；所述下孔板包括带下小孔的下板面以及位于下板面下方且与下小孔连通的用于盛放水或GUS染液的若干凹槽，所述下小孔与上小孔一一对应，所述凹槽供所述孔道插入。

【技术特征摘要】
1.一种高通量筛选转基因纯合植株的装置，其特征在于，包括上、下套叠的双层孔板；所述上孔板包括带若干上小孔的上板面以及位于上板面下方且与上小孔连通的若干孔道；所述孔道的孔径由上至下逐渐缩小，孔道用于放置待测植株的种子，且种子恰好卡在孔道的底部开口处；所述下孔板包括带下小孔的下板面以及位于下板面下方且与下小孔连通的用于盛放水或GUS染液的若干凹槽，所述下小孔与上小孔一一对应，所述凹槽供所述孔道插入。2.如权利要求1所述的高通量筛选转基因纯合植株的装置，其特征在于，所述上板面为方形，上小孔横纵均匀排布在上板面上；所述下板面为方形，下小孔横纵均匀排布在下板面上。3.如权利要求1所述的高通量筛选转基因纯合植株的装置，其特征在于，所述上板面上设有用于显示上小孔横纵坐标位置的标识。4.如权利要求1所述的高通量筛选转基因纯合植株的装置，其特征在于，所述上板面设有将所有上小孔覆盖住的透气封膜。5.如权利要求1所述的高通量筛选转基因纯合植株的装置，其特征在于，所述孔道的底部开口伸入至凹槽的中部。6.如权利要求1所述的高通量筛选转基因纯合植株的装置，其特征在于，所述上小孔和下小...

【专利技术属性】
技术研发人员：舒庆尧，黄文倩，芦海平，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33