The invention relates to a method for evaluating the editing efficiency or miss-target frequency of CRISPR/Cas9 gene, which belongs to the field of bioengineering. It mainly includes three parts: firstly, in order to quickly screen transgenic plants, the marker gene mCherry is inserted into the expression vector; secondly, in order to quickly identify the editing efficiency and miss-target frequency of CRISPR/Cas9 gene, fatty acid dehydrogenase FAD2 and FAD3 are used as target genes. Finally, by detecting the composition of C18 unsaturated fatty acids in transgenic plants after mutation of target genes, edited plants and unedited plants can be quickly and simply screened out, so that the editing efficiency and miss-target effect of a specific CRISPR/Cas9 gene editing system can be determined quickly, accurately and efficiently.
【技术实现步骤摘要】
一种评估CRISPR/Cas9基因编辑效率或脱靶频率的方法
本专利技术属于生物工程领域,涉及CRISPR/Cas9基因编辑,具体地,涉及一种评估CRISPR/Cas9基因编辑效率或脱靶频率的方法。
技术介绍
CRISPR的全称是“ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats”,即成簇的、规律间隔的短回文重复序列,是基因组中一个含有多个短重复序列的位点,这种位点在细菌和古细菌胞内起到了一种获得性免疫的作用。通过CRISPR簇的侧翼序列分析发现,在其附近存在一个多态性家族基因。该家族编码的蛋白质均含有可与核酸发生作用的功能域(具有核酸酶、解旋酶、整合酶和聚合酶等活性),并且与CRISPR区域共同发挥作用,因此被命名为CRISPR关联基因(CRISPRassociated),缩写为Cas。Cas基因与CRISPR共同进化,共同构成一个高度保守的系统。目前发现的CRISPR/Cas系统有三种不同类型即I型、II型和III型,其中I类和III类需要多种Cas蛋白共同发挥作用,而II类系统只需要一个Cas9蛋白就能够发挥CRISPR系统的免疫作用。CRISPR簇序列由一个前导区(Leader)、多个短而高度保守的重复序列区(Repeat)和多个间隔区(Spacer)组成。当细菌抵御噬菌体等外源DNA入侵时CRISPR转录为crRNA(CRISPR-derivedRNA),crRNA通过碱基配对与tracrRNA(trans-activatingRNA)结合形成tracrRNA/crRNA复合物,此复合物引导核 ...
【技术保护点】
1.一种评估CRISPR/Cas9基因编辑效率或脱靶频率的方法,其特征在于:包括以下步骤:步骤一:构建CRISPR/Cas9基因编辑载体:将荧光蛋白报告基因与编码sgRNA序列的DNA片段插入到携带CRISPR/Cas9的编辑载体中;所述sgRNA包含以脂肪酸去饱和酶
【技术特征摘要】
1.一种评估CRISPR/Cas9基因编辑效率或脱靶频率的方法,其特征在于:包括以下步骤:步骤一:构建CRISPR/Cas9基因编辑载体:将荧光蛋白报告基因与编码sgRNA序列的DNA片段插入到携带CRISPR/Cas9的编辑载体中;所述sgRNA包含以脂肪酸去饱和酶FAD2或FAD3基因为基础设计获得的靶序列;步骤二:将步骤一构建好的载体利用农杆菌介导法转化植株,再利用荧光光蛋白报告基因筛选植株转基因后代;步骤三:利用植株脂肪酸组分的变化确定编辑效率或脱靶频率。2.如权利要求1所述的一种评估CRISPR/Cas9基因编辑效率或脱靶频率的方法,其特征在于:所述编辑载体中包含单个或两个sgRNA。3.如权利要求1所述的一种评估CRISPR/Cas9基因编辑效率或脱靶频率的方法,其特征在于:步骤三所述利用植株脂肪酸组变化,是通过检测转基因阳性植株中C18不饱和脂肪酸的组分筛选出被编辑的植株进而确定编辑效率,或计算脱靶频率。4.一种CRISPR/Cas9基因编辑载体,其特征在于:包括单个sgRNA或两个sgRNA组成的表达元件、Cas9蛋...
【专利技术属性】
技术研发人员:朱丽颖,郑月萍,徐雪珍,段芊芊,郑志富,
申请(专利权)人:浙江农林大学,
类型:发明
国别省市:浙江,33
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