一种评估CRISPR/Cas9基因编辑效率或脱靶频率的方法技术

技术编号:21333798 阅读:31 留言:0更新日期:2019-06-13 20:19
本发明专利技术涉及一种评估CRISPR/Cas9基因编辑效率或脱靶频率的方法,属于生物工程领域,主要包括三个部分:首先为了快速筛选转基因植株,选择标记基因mCherry插入表达载体中;其次为了快速鉴定CRISPR/Cas9基因的编辑效率和脱靶频率,将脂肪酸脱氢酶FAD2、FAD3作为靶基因插入载体中;最后利用靶基因突变后脂肪酸组分的变化,通过检测转基因阳性植株中C18不饱和脂肪酸的组成快速简便地筛选出被编辑的植株和未被编辑的植株,从而快速、准确、高效地确定特定的CRISPR/Cas9基因编辑系统的编辑效率和脱靶效应。

A Method for Evaluating the Editing Efficiency or Mistargeting Frequency of CRISPR/Cas9 Gene

The invention relates to a method for evaluating the editing efficiency or miss-target frequency of CRISPR/Cas9 gene, which belongs to the field of bioengineering. It mainly includes three parts: firstly, in order to quickly screen transgenic plants, the marker gene mCherry is inserted into the expression vector; secondly, in order to quickly identify the editing efficiency and miss-target frequency of CRISPR/Cas9 gene, fatty acid dehydrogenase FAD2 and FAD3 are used as target genes. Finally, by detecting the composition of C18 unsaturated fatty acids in transgenic plants after mutation of target genes, edited plants and unedited plants can be quickly and simply screened out, so that the editing efficiency and miss-target effect of a specific CRISPR/Cas9 gene editing system can be determined quickly, accurately and efficiently.

【技术实现步骤摘要】
一种评估CRISPR/Cas9基因编辑效率或脱靶频率的方法
本专利技术属于生物工程领域,涉及CRISPR/Cas9基因编辑,具体地,涉及一种评估CRISPR/Cas9基因编辑效率或脱靶频率的方法。
技术介绍
CRISPR的全称是“ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats”,即成簇的、规律间隔的短回文重复序列,是基因组中一个含有多个短重复序列的位点,这种位点在细菌和古细菌胞内起到了一种获得性免疫的作用。通过CRISPR簇的侧翼序列分析发现,在其附近存在一个多态性家族基因。该家族编码的蛋白质均含有可与核酸发生作用的功能域(具有核酸酶、解旋酶、整合酶和聚合酶等活性),并且与CRISPR区域共同发挥作用,因此被命名为CRISPR关联基因(CRISPRassociated),缩写为Cas。Cas基因与CRISPR共同进化,共同构成一个高度保守的系统。目前发现的CRISPR/Cas系统有三种不同类型即I型、II型和III型,其中I类和III类需要多种Cas蛋白共同发挥作用,而II类系统只需要一个Cas9蛋白就能够发挥CRISPR系统的免疫作用。CRISPR簇序列由一个前导区(Leader)、多个短而高度保守的重复序列区(Repeat)和多个间隔区(Spacer)组成。当细菌抵御噬菌体等外源DNA入侵时CRISPR转录为crRNA(CRISPR-derivedRNA),crRNA通过碱基配对与tracrRNA(trans-activatingRNA)结合形成tracrRNA/crRNA复合物,此复合物引导核酸酶Cas9蛋白在与crRNA配对的外源DNA序列靶位点剪切双链DNA。所以当前CRISPR/Cas9系统包括Cas9蛋白和sgRNA,这种人工设计的sgRNA通过碱基互补配对结合到靶序列,引导Cas9蛋白结合到特定区域发挥作用,实现定点编辑。通过理论的不断发展和技术的不断地推进,使CRISPR/Cas9在基因编辑中得到广泛应用。高效的CRISPR/Cas9系统可以极大地节省人力、物力和财力,故一个好的编辑载体将会推进实验的进程。近期,Wang等(2015)报道了一种新型的CRISPR/Cas9编辑载体,该载体中的Cas9蛋白基因由卵细胞特异性表达的EC1.2基因的启动子驱动,以此可以有效地避免组成型过表达启动子常产生的嵌合型T1代突变体。另外,该载体中两个串联的sgRNAs取代了传统的单个sgRNA,从而可以同时对两个甚至多个基因进行编辑,避免了传统的杂交方法获得多突变体过程中的基因连锁和基因渗透现象。CRISPR/Cas9是继锌指核酸内切酶(ZFN)”、“类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)”之后出现的第三代“基因组定点编辑技术”。这三种技术都是在特定的DNA靶序列产生DSBs,通过非同源末端连接(NHEJ)和同源修复(HDR)来修复DSBs,在修复DSBs的过程中发生自发错误或人为引入突变或修饰,对目的基因进行精准的定点修饰。相较于ZFN和TALEN,CRISPR/Cas9系统有着可用位置多、应用潜力大、操纵方便等许多优点,在2013年CRISPR/Cas9作用机制与使用方法得以明确后,ZFN与TALEN的使用逐渐减少,而CRISPR/Cas9系统呈现爆炸性增长,慢慢取代了前两代基因编辑技术,成为了主流的第三代的基因编辑的技术。但是如何高效地评估CRISPR/Cas9基因编辑效率的问题还有待解决。如果我们能够找到一种靶基因,通过待评估的CRISPR/Cas9编辑载体编辑后出现易于检测的表型,计算这种表型出现的频率即可得到编辑效率。明确了该编辑载体的编辑效率之后就可以对准确计算筛选突变体所需植株的规模提供参考,以及为该载体的大规模推广提供依据。虽然CRISPR/Cas9基因编辑技术相比锌指核酸酶(ZFNs)和转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)技术更易于操作,更加高效,但研究发现,设计的sgRNA会与非靶点DNA序列错配,引入非预期的基因突变,即脱靶效应(Off-targeteffects)。脱靶效应严重制约了CRISPR/Cas9基因编辑技术的广泛应用。目前,用来检测脱靶效应的方法主要有ChIP-seq法,GUIDE-seq法,Digenome-seq技术,以及利用整合酶缺陷的慢病毒载体来检测脱靶效应。但这些方法往往费时费力,甚至敏感度不高。用来检测CRISPR/Cas9是否编辑的方法有错配酶法,高通量测序法,分子鉴定,高分辨率溶解曲线等,这些方法都存在一定的缺点,在大规模筛选中不适用。因此,研发出一种可以高效评估CRISPR/Cas9编辑载体的脱靶频率的体系具有重要的实际应用价值。在拟南芥中,FAD2是位于内质网的油酸(18:1)去饱和酶,负责在油酸中引入第二个双键形成亚油酸(18:2)。同样位于内质网的亚油酸去饱和酶FAD3则是催化亚油酸形成亚麻酸。因此,突变体fad2和fad3中C18不饱和脂肪酸的组成均较野生型有极大的区别。
技术实现思路
为了解决现有技术中的不足,本专利技术的目的一在于提供一种评估CRISPR/Cas9基因编辑效率或脱靶频率的方法,目的二在于提供一种CRISPR/Cas9基因编辑载体;通过对现有的CRISPR/Cas9基因编辑载体进行设计和改造,将以脂肪酸脱氢酶FAD2或FAD3为基础设计的靶基因插入载体中;最后利用靶基因突变后脂肪酸组分的变化,通过检测转基因阳性植株中C18不饱和脂肪酸的组成快速简便地筛选出被编辑的植株和未被编辑的植株,从而确定特定的CRISPR/Cas9基因编辑系统的编辑效率和脱靶效应。为了实现上述目的,本专利技术采用的具体方案为:一种评估CRISPR/Cas9基因编辑效率或脱靶频率的方法,包括以下步骤:步骤一:构建CRISPR/Cas9基因编辑载体:将荧光蛋白报告基因与编码sgRNA序列的DNA片段插入到携带CRISPR/Cas9的编辑载体中;所述sgRNA包含以脂肪酸去饱和酶FAD2或FAD3基因为基础设计获得的靶序列;步骤二:将步骤一构建好的载体利用农杆菌介导法转化植株,再利用荧光光蛋白报告基因筛选植株转基因后代;步骤三:利用植株脂肪酸组分的变化确定编辑效率或脱靶频率。作为对上述方案的进一步优化,所述编辑载体中包含单个或两个sgRNA,采用两个sgRNAs可以同时对两个甚至多个基因进行编辑。作为对上述方案的进一步优化,步骤三所述利用植株脂肪酸组变化,是通过检测转基因阳性植株中C18不饱和脂肪酸的组分筛选出被编辑的植株进而确定编辑效率,或计算脱靶频率。本专利技术进一步提供一种CRISPR/Cas9基因编辑载体,包括单个sgRNA或两个sgRNA组成的表达元件、Cas9蛋白基因和mCherry荧光蛋白基因。作为对上述编辑载体的进一步优化,所述mCherry荧光蛋白基因由种子特异性表达的At2S3基因启动子驱动。作为对上述编辑载体的更进一步优化,所述sgRNA包含两条以FDA2基因为基础设计的两条靶序列T1和T2,或者包含两条以FDA3基因为基础设计的两条靶序列T3和T4;其中,T1的碱基序列如SEQIDNO:01所示,T2的碱基序列如SEQIDNO:02所示,T3的碱基序列如SEQIDNO:03本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种评估CRISPR/Cas9基因编辑效率或脱靶频率的方法,其特征在于:包括以下步骤:步骤一:构建CRISPR/Cas9基因编辑载体:将荧光蛋白报告基因与编码sgRNA序列的DNA片段插入到携带CRISPR/Cas9的编辑载体中;所述sgRNA包含以脂肪酸去饱和酶

【技术特征摘要】
1.一种评估CRISPR/Cas9基因编辑效率或脱靶频率的方法,其特征在于:包括以下步骤:步骤一:构建CRISPR/Cas9基因编辑载体:将荧光蛋白报告基因与编码sgRNA序列的DNA片段插入到携带CRISPR/Cas9的编辑载体中;所述sgRNA包含以脂肪酸去饱和酶FAD2或FAD3基因为基础设计获得的靶序列;步骤二:将步骤一构建好的载体利用农杆菌介导法转化植株,再利用荧光光蛋白报告基因筛选植株转基因后代;步骤三:利用植株脂肪酸组分的变化确定编辑效率或脱靶频率。2.如权利要求1所述的一种评估CRISPR/Cas9基因编辑效率或脱靶频率的方法,其特征在于:所述编辑载体中包含单个或两个sgRNA。3.如权利要求1所述的一种评估CRISPR/Cas9基因编辑效率或脱靶频率的方法,其特征在于:步骤三所述利用植株脂肪酸组变化,是通过检测转基因阳性植株中C18不饱和脂肪酸的组分筛选出被编辑的植株进而确定编辑效率,或计算脱靶频率。4.一种CRISPR/Cas9基因编辑载体,其特征在于:包括单个sgRNA或两个sgRNA组成的表达元件、Cas9蛋...

【专利技术属性】
技术研发人员:朱丽颖郑月萍徐雪珍段芊芊郑志富
申请(专利权)人:浙江农林大学
类型:发明
国别省市:浙江,33

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