抑制菌体自溶的地衣芽孢杆菌工程菌及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种抑制菌体自溶的地衣芽孢杆菌工程菌及其构建方法和应用，属于微生物菌种改造领域。所述抑制菌体自溶的地衣芽孢杆菌工程菌采用敲除pcf基因获得，所述pcf基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术制备的抑制菌体自溶的地衣芽孢杆菌工程菌，生物量得到明显提高，与未改造地衣芽孢杆菌相比，自溶率降低了11.2％，在一定程度上改善了地衣芽孢杆菌菌体自溶现象，可有效的提高目标淀粉酶的发酵生产，具有良好的应用前景。

Engineering Bacillus licheniformis strain inhibiting autolysis of bacteria and its construction method and Application

The invention discloses an engineering Bacillus licheniformis strain which inhibits autolysis of bacteria and its construction method and application, belonging to the field of microbial strain transformation. The engineered Bacillus licheniformis strain, which inhibits autolysis of bacteria, is obtained by knocking out the PCF gene, and the nucleotide sequence of the PCF gene is shown as SEQ ID NO.1. The engineering Bacillus licheniformis strain prepared by the invention can significantly increase the biomass, reduce the autolysis rate by 11.2% compared with the unmodified Bacillus licheniformis strain, improve the autolysis phenomenon of Bacillus licheniformis strain to a certain extent, effectively improve the fermentation production of target amylase, and has a good application prospect.

【技术实现步骤摘要】
抑制菌体自溶的地衣芽孢杆菌工程菌及其构建方法和应用
本专利技术涉及微生物菌种改造领域，具体涉及一种抑制菌体自溶的地衣芽孢杆菌工程菌及其构建方法和应用。
技术介绍
地衣芽孢杆菌是芽孢杆菌中较具应用潜力的生产菌种之一，能够发酵生产蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等多种酶，在纺织、食品、医药等行业有广泛应用。酶高效生产最重要的条件之一就是高浓度的菌体，而本专利技术所涉及的地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)DL-1合成酶能力强，但菌体易自溶，在进行目标酶高效表达的基因工程改造后，菌体自溶现象更加明显，菌体生长的稳定期及有效产酶时间缩短。为了保证生产菌株的连续高密度发酵，提高发酵生产效率，需要采取有效措施对菌体自溶进行控制。菌体自溶主要和外部环境以及菌体自身的某些特定的基因表达有关。基因表达调控是菌体自溶的一个关键性内因，其中，原噬菌体基因与芽孢杆菌菌体自溶关系密切，它以一种潜伏的形式整合在细菌基因组上，通常控制其表达的基因处于关闭状态，特定条件诱导后，它就会大量复制，最后将细菌裂解。PBLB是地衣芽孢杆菌中的一种原噬菌体，在正常情况下也会有少量复制，在丝裂霉素C等条件诱导下会进行大量复制，最终使地衣芽孢杆菌裂解自溶。
技术实现思路
为解决地衣芽孢杆菌菌体存在自溶不足，本专利技术的目的在于提供一种抑制菌体自溶的地衣芽孢杆菌工程菌及其构建方法和应用。为解决上述技术问题，本专利技术提供技术方案如下：本专利技术，一方面提供一种抑制菌体自溶的地衣芽孢杆菌工程菌，所述抑制菌体自溶的地衣芽孢杆菌工程菌采用敲除pcf基因获得，所述pcf基因核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。PBLB的结构蛋白以及与裂解细胞壁相关的酶是由pcf因子控制表达的，通过对pcf基因进行敲除，结合营养条件控制可以抑制地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)DL-1菌体自溶，提高生物量的积累，提升发酵产物的生产能力。进一步的，所述敲除pcf基因的方法为同源重组单交换方法；所述抑制菌体自溶的地衣芽孢杆菌工程菌的培养基为添加0.1％葡萄糖、2.5％甘油的LB培养基。另一方面，本专利技术还提供上述抑制菌体自溶的地衣芽孢杆菌工程菌的构建方法，包括：步骤1：提取地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)DL-1基因组DNA，以DNA为模板，设计上下游引物pcfF和pcfR，进行PCR扩增，获得pcf基因片段，pcf基因核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；步骤2：提取pHT01质粒DNA，以该DNA为模板，设计上下游引物CmrF和CmrR，进行PCR扩增，获得氯霉素抗性Cmr基因片段，Cmr基因核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；步骤3：将步骤1制备得到的pcf基因片段与步骤2制备得到的Cmr基因片段，采用重叠延伸PCR进行融合，获得同源重组pcf-Cmr片段；步骤4：将步骤3获得的同源重组pcf-Cmr片段，酶切，浓缩后，电转化至地衣芽孢杆菌感受态细胞；步骤5：将步骤4获得的感受态细胞，复苏后，涂布含氯霉素的琼脂固体培养基上，筛选具有氯霉素抗性的阳性重组菌，制得具有抑制菌体自溶的地衣芽孢杆菌工程菌。其中，所述步骤1中，pcfF和pcfR引物序列为：pcfF：CGCGGATCCTGTATAAGCCCTATCAAGATGpcfR：TGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGTTTCACATTGGTTTGAA-CAGPCR扩增体系为：(B.licheniformis)DL-1基因组模板1.5μL，上游引物pcfF1.5μL，下游引物pcfR1.5μL，2×PhantaMaxMasterMix25μL，ddH2O20.5μL，总体积50μL；PCR扩增反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸20s，30循环，72℃终延伸10min。其中，所述步骤2中CmrF和CmrR引物序列为：CmrF：CTACTGTTCAAACCAATGTGAAACTTTTGCTGGCCTTTTGCTC-ACCmrR：CGCGGATCCTAGTGACTGGCGATGCTGTCGGPCR扩增体系为：pHT01质粒模板1.5μL，上游引物CmrF1.5μL，下游引物CmrR1.5μL，2×PhantaMaxMasterMix25μL，ddH2O20.5μL，总体积50μL；PCR扩增反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸40s，30循环，72℃终延伸10min。其中，所述步骤3中，重叠延伸PCR所使用的引物序列为pcfF和CmrR；重叠延伸PCR扩增分为初次PCR扩增和二次PCR扩增；所述初次PCR扩增的体系为：pcf基因片段2μL，Cmr基因片段2μL，2×PhantaMaxMasterMix12.5μL，ddH2O8.5μL，总体积25μL；初次PCR扩增反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸40s，5循环，72℃终延伸5min；所述二次PCR扩增的体系为：在初次PCR扩增体系中补加如下试剂，上游引物pcfF1.5μL，下游引物CmrR1.5μL，2×PhantaMaxMasterMix12.5μL，ddH2O9.5μL；所述二次PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，30循环，72℃终延伸10min。其中，步骤4中，酶切的体系及反应条件如下：pcf-Cmr同源重组片段20μL，BamHⅠ内切酶2μL，10×FastDigestBuffer4μL，ddH2O4μL，总体积30μL；37℃，酶切2h，获得酶切后产物；浓缩的步骤为：向酶切后的产物中，加入1/10体积3mol/L醋酸钠溶液和2.5倍体积的无水乙醇，-20℃放置20min，12000r/min离心5min得DNA沉淀，加入70％乙醇重悬DNA沉淀，12000r/min离心5min除去乙醇，37℃风干，加入25μLddH2O重悬，得到pcf-Cmr浓缩重组片段；电转化的步骤为：将(B.licheniformis)DL-1感受态细胞与pcf-Cmr浓缩重组片段于冰上以10:1比例轻轻混匀，将混合物移入2mm电转杯，2100V、5ms电转，然后立即加入1mLRM培养基，37℃，180r/min复苏4h后涂布于含氯霉素(25μg/mL)的LB固体培养基中培养。进一步的，所述的抑制菌体自溶的地衣芽孢杆菌工程菌的构建方法，还包括步骤6：将步骤5制备得到的抑制菌体自溶的地衣芽孢杆菌工程菌接种到营养条件不同的培养基上，进行营养优化培养。进一步的，接种量为单菌落/50ml培养基，培养条件为37℃，200r/min培养24h；所述培养基分别为含质量百分比为0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％甘油的LB培养基；含质量百分比为0.1％、0.3％、0.5％、0.8％、1％葡萄糖的LB培养基；含质量百分比为0.1％、0.3％、0.5％、0.8％、1％葡萄糖的LBG培养基；含质量百分比为0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％甘油的LBP培养基；所述LB培养基由以下质量百分比组分组成：蛋白胨1％、酵母浸粉0.5％、氯化钠1％；用5mol/LNaOH调节培养基pH为7.0；本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抑制菌体自溶的地衣芽孢杆菌工程菌，其特征在于，所述抑制菌体自溶的地衣芽孢杆菌工程菌采用敲除pcf基因获得，所述pcf基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种抑制菌体自溶的地衣芽孢杆菌工程菌，其特征在于，所述抑制菌体自溶的地衣芽孢杆菌工程菌采用敲除pcf基因获得，所述pcf基因核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.根据权利要求1所述的抑制菌体自溶的地衣芽孢杆菌工程菌，其特征在于，所述敲除pcf基因的方法为同源重组单交换方法；所述抑制菌体自溶的地衣芽孢杆菌工程菌的培养基为添加0.1％葡萄糖、2.5％甘油的LB培养基。3.根据权利要求1或2所述的抑制菌体自溶的地衣芽孢杆菌工程菌的构建方法，其特征在于，包括：步骤1：提取地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)DL-1基因组DNA，以DNA为模板，设计上下游引物pcfF和pcfR，进行PCR扩增，获得pcf基因片段，pcf基因核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；步骤2：提取pHT01质粒DNA，以该DNA为模板，设计上下游引物CmrF和CmrR，进行PCR扩增，获得氯霉素抗性Cmr基因片段，Cmr基因核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；步骤3：将步骤1制备得到的pcf基因片段与步骤2制备得到的Cmr基因片段，采用重叠延伸PCR进行融合，获得同源重组pcf-Cmr片段；步骤4：将步骤3获得的同源重组pcf-Cmr片段，酶切，浓缩后，电转化至地衣芽孢杆菌感受态细胞；步骤5：将步骤4获得的感受态细胞，复苏后，涂布含氯霉素的琼脂固体培养基上，筛选具有氯霉素抗性的阳性重组菌，制得具有抑制菌体自溶的地衣芽孢杆菌工程菌。4.根据权利要求3所述的抑制菌体自溶的地衣芽孢杆菌工程菌的构建方法，其特征在于，所述步骤1中，pcfF和pcfR引物序列为：pcfF：CGCGGATCCTGTATAAGCCCTATCAAGATGpcfR：TGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGTTTCACATTGGTTTGAA-CAGPCR扩增体系为：(B.licheniformis)DL-1基因组模板1.5μL，上游引物pcfF1.5μL，下游引物pcfR1.5μL，2×PhantaMaxMasterMix25μL，ddH2O20.5μL，总体积50μL；PCR扩增反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸20s，30循环，72℃终延伸10min；所述步骤2中CmrF和CmrR引物序列为：CmrF：CTACTGTTCAAACCAATGTGAAACTTTTGCTGGCCTTTTGCTC-ACCmrR：CGCGGATCCTAGTGACTGGCGATGCTGTCGGPCR扩增体系为：pHT01质粒模板1.5μL，上游引物CmrF1.5μL，下游引物CmrR1.5μL，2×PhantaMaxMasterMix25μL，ddH2O20.5μL，总体积50μL；PCR扩增反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸40s，30循环，72℃终延伸10min。5.根据权利要求3所述的抑制菌体自溶的地衣芽孢杆菌工程菌的构建方法，其特征在于，所述步骤3中，重叠延伸PCR所使用的引物序列为pcfF和CmrR；重叠延伸PCR扩增分为初次PCR扩增和二次PCR扩增；所述初次PCR扩增的体系为：pcf基因片段2μL，Cmr基因片段2μL，2×PhantaMaxMasterMix12.5μL，ddH2O8.5μL，总体积2...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖静，李子源，张虎，王瑞明，
申请(专利权)人：齐鲁工业大学，
类型：发明
国别省市：山东,37