一种简单有效的细菌真菌菌落PCR通用程序制造技术

本发明专利技术涉及一种简单有效的细菌真菌菌落PCR通用程序。所述细菌真菌菌落PCR通用程序为，将细菌、真菌分别接种于相应的培养基上进行培养，培养基长出明显肉眼可见的菌落为实验可用菌落；通过机械研磨破碎微生物细胞，在细胞破碎沉淀物中仅加入TE缓冲液后即得到DNA模板，所得DNA模板可直接用于PCR扩增；除引物不同外，细菌、真菌后续PCR扩增的反应体系、反应程序完全相同。本发明专利技术方法安全易操作，成功率高，结果可靠，可用于革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌、酵母和丝状真菌特定片段的扩增，简化了菌落PCR的步骤，降低了时间成本和经济成本，适合应用于大批量、多类别环境微生物的快速鉴定。

A Simple and Effective Common Program for Bacterial and Fungal Colony PCR

The present invention relates to a simple and effective general program for bacterial and fungal colony PCR. The general procedure of bacterial and fungal colony PCR is that bacteria and fungi are inoculated on the corresponding culture medium for culture, and the obvious colony visible to the naked eye is grown on the culture medium as the available colony for experiment; DNA template is obtained by mechanical grinding of microbial cells and adding TE buffer only in the cell breakage sediment, and the obtained DNA template can be directly used for PCR amplification except for primers. In addition, the reaction system and procedure of subsequent PCR amplification of bacteria and fungi are identical. The method is safe, easy to operate, has high success rate and reliable results, and can be used for the amplification of specific fragments of Gram-negative bacteria, Gram-positive bacteria, yeast and filamentous fungi, simplifies the steps of colony PCR, reduces the time cost and economic cost, and is suitable for rapid identification of large-scale and multi-category environmental microorganisms.

【技术实现步骤摘要】
一种简单有效的细菌真菌菌落PCR通用程序
本专利技术涉及一种简单有效的细菌真菌菌落PCR通用程序。
技术介绍
PCR技术已广泛应用于生物学、医学、考古学等各个领域的基因研究和分析。PCR快速鉴定微生物特定DNA序列是常规分子生物学研究的基本要求，而菌种模板DNA的成功提取是PCR技术的基础。常规PCR扩增前的菌种模板DNA制备需要经过破壁、抽提、沉淀、纯化等步骤，操作繁琐、耗时长，反复操作会造成DNA的损失，而且用于DNA抽提的酚、氯仿等试剂不利于操作者的身体健康。菌落PCR是一种利用PCR技术筛选特定DNA序列的单个菌落的方法，由于不需要从大量微生物培养物中分离纯化基因组DNA，菌落PCR可以快速、简单的确定少量菌所包含特定的DNA序列，除了微生物分类鉴定外，菌落PCR还经常用于基因扩增、重组整合子的鉴定和质粒构建、医学诊断等领域。目前，革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌、酵母、丝状真菌的菌落PCR方法已有报道[Woodman,MichaelE.DirectPCRofintactbacteria(colonyPCR).[J].CurrentProtocolsinMicrobiology,2008,Appendix3:Appendix3D.]，[AmbergDC,BurkeDJ,StrathernJN.YeastcolonyPCR.[J].CshProtocols,2006,2006(1).]，[张晓利,吕雪莲,沈永年,等.菌落PCR技术快速鉴别丝状真菌的实验研究[J].中华皮肤科杂志,2011,44(8).]，这些方法主要是在一定的缓冲液中重新悬浮微生物细胞，然后进行必要的煮沸、冷冻步骤以促进细胞裂解释放DNA，但每种方法只对特定类别的微生物有效，细菌、酵母、丝状真菌的菌落PCR操作参数各有不同，不具有广泛适用性，目前国内尚无细菌真菌通用的菌落PCR的报道。此外，由于真菌细胞外层有较厚且坚韧的细胞壁，单纯的热力作用难以使细胞裂解，因此真菌特别是丝状真菌菌落PCR效果普遍不理想。实际上目前大部分实验室采用液氮冷冻干燥研磨破碎丝状真菌细胞壁，但这种方法步骤繁琐，液氮研磨费时费力，容易冻伤操作人员，除此之外，细胞液氮研磨后往往需要用到有毒的有机试剂进一步提纯，不利于操作人员健康安全。
技术实现思路
本专利技术提供一种简单有效的细菌真菌菌落PCR通用程序，其操作简单，广泛适用于革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌、酵母和丝状真菌特定DNA序列的扩增，扩增阳性率很高。所述一种简单有效的细菌真菌菌落PCR通用程序为，将细菌、真菌培养物分别接种于相应的培养基上，进行培养，培养基上长出明显肉眼可见单菌落时，作为实验可用菌落，制备DNA模板，进行PCR扩增。上述培养基和培养温度，为公知常识，一般细菌采用牛肉膏蛋白胨培养基，在37℃下培养；一般真菌采用PDA培养基，在28℃下培养。DNA模板的制备方法为：细菌、真菌DNA模板的制备方法完全相同，操作步骤如下：用无菌移液器吸头或灭菌牙签直接从待测培养皿中挑取实验菌落，并移入装有无菌水的离心管中，向离心管中加入少量高压灭菌的不锈钢研磨珠后放入研磨仪中研磨，研磨后取研磨液离心，除去离心上清液后加入少量TE缓冲液重悬，所制重悬液即可用作细菌真菌菌落PCR通用程序的DNA模板。所述挑取实验菌落应尽可能从实验菌落中挑取适量的菌体，如果菌体量过少，会降低PCR扩增效率，而过多的菌体可能使PCR扩增受到抑制。根据申请人研究经验，当研磨液离心沉淀为5～30mg时，细菌和酵母菌落PCR结果较为理想；当研磨液离心沉淀为10～50mg时，丝状真菌菌落PCR结果较为理想。所述无菌水的体积为400～1000μl；离心管的容积为1.5～2ml，不锈钢研磨珠直径为1～3mm，用量为1.5～2.5g；研磨仪为全自动样品快速研磨仪，研磨频率为60～80Hz，时间为5～10min；离心转速为8000～10000r/min，时间为1～2min；TE缓冲液体积为20～60μl。作为优选方案，细菌真菌菌落PCR通用程序DNA模板的制备方法为：用无菌移液器吸头从实验菌落中挑取适量菌体，并移入装有800μl无菌水的1.5ml离心管中，向离心管中加入2.0g高压灭菌的不锈钢研磨珠后，盖紧，放入研磨仪中70Hz研磨7min，然后取研磨液放入一个新的1.5ml离心管中，8000r/min离心2min，弃上清后加入20μlTE缓冲液重悬，将重悬液8000r/min离心1min，离心后的上清液即可用作细菌真菌菌落PCR通用程序的DNA模板。细菌真菌通用菌落PCR反应体系为：DNA模板1～5μl，上下游引物各1μl，PCRMastermix12.5μl，补ddH2O至25μl。所述上下游引物为公知常识，对于微生物鉴定，一般使用通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R(5'-TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3')对细菌16SrRNA进行PCR扩增，使用通用引物ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')和ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')对真菌ITS区进行PCR扩增。作为本领域公知常识，PCRMasterMix是包含TaqDNA聚合酶、dNTP以及PCR所需的除了DNA模板和引物以外的所有组分的2X浓缩溶液。PCR扩增程序为：细菌、真菌PCR扩增程序完全相同，在常规PCR程序基础上略加修改，操作步骤如下：95℃预变性3～5min；循环数(30～35次)×(94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸50s)；72℃延伸10min。制备微生物DNA模板，需要DNA从微生物细胞中释放出来，所以细胞破碎是非常重要的一步。细胞破碎主要分为化学法和机械法两大类，相比于化学法，机械研磨法可以短时间切碎细胞，且具有通用性[梁蕊芳,徐龙,岳明强.细胞破碎技术应用研究进展[J].内蒙古农业科技,2013(1):113-114.]。不同类别微生物细胞破碎难度不一，通常革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌、酵母、丝状真菌的细胞破碎难度依次增加。如果机械外力过小，难以使微生物细胞破裂；但如果机械外力过大，会导致微生物基因组DNA受到破坏，无法进行后续的PCR扩增。申请人经研究发现，利用钢珠研磨破碎各种类别微生物细胞，70Hz研磨7min左右，所制得的DNA模板均能成功进行PCR扩增，研磨时间过长或过短都无法达到以上效果，所以7min左右的研磨时间是本专利技术细菌真菌菌落PCR通用程序的关键。在革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌、酵母、丝状真菌菌落PCR通用程序试验中，申请人设置了常规菌落PCR作为方法对比，并设立了常规PCR的阳性对照和未加DNA模板的阴性对照，以减少假阳性或假阴性结果。本专利技术细菌真菌菌落PCR通用程序，PCR扩增阳性率明显优于常规菌落PCR，具有显著的通用性，不仅解决了常规PCR微生物基因组DNA提取步骤繁琐、破壁难等问题，同时也解决了常规菌落PCR阳性率低、细菌真菌处理方法差异性问题。本专利技术方法安全易操作，成功率高，结果可靠，普遍适用于革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌、酵母和丝状真菌，通过机械研磨破碎微生物细胞，可在15min内完成PCR模板的制备，大大降低了时间成本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种细菌真菌菌落PCR通用程序，其特征在于，将细菌、真菌分别接种于相应的培养基上进行培养，培养基长出明显肉眼可见的菌落为实验可用菌落；通过机械研磨破碎微生物细胞，在细胞破碎沉淀物中仅加入TE缓冲液后即得到DNA模板，所得DNA模板可直接用于PCR扩增；除引物不同外，细菌、真菌后续PCR扩增的反应体系、反应程序完全相同。

【技术特征摘要】
1.一种细菌真菌菌落PCR通用程序，其特征在于，将细菌、真菌分别接种于相应的培养基上进行培养，培养基长出明显肉眼可见的菌落为实验可用菌落；通过机械研磨破碎微生物细胞，在细胞破碎沉淀物中仅加入TE缓冲液后即得到DNA模板，所得DNA模板可直接用于PCR扩增；除引物不同外，细菌、真菌后续PCR扩增的反应体系、反应程序完全相同。2.如权利要求1所述的细菌真菌菌落PCR通用程序，其特征在于，细菌、真菌DNA模板的制备方法完全相同，具体步骤如下：用无菌移液器吸头或灭菌牙签直接从待测培养皿中挑取实验菌落，并移入装有无菌水的离心管中，向离心管中加入少量高压灭菌的不锈钢研磨珠后放入研磨仪中研磨，研磨后取研磨液离心，除去离心上清液后加入少量TE缓冲液重悬，所制...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪立平，万红芳，周滟晴，赵帅东，
申请(专利权)人：上海海洋大学，
类型：发明
国别省市：上海,31