本发明专利技术公开了ILP‑2作为药物靶点在乳腺癌药物中的应用及ILP‑2干扰片段。本发明专利技术明确了凋亡抑制蛋白ILP‑2与ECM1共同作用，通过ECM1‑mTOR通路影响乳腺癌细胞MCF‑7的生长和凋亡，在乳腺癌细胞MCF‑7的生长中起着积极的作用，为抑制肿瘤细胞生长提供了新的药物靶点并公开了一种具有良好干扰效果的ILP‑2干扰片段。
Application of ILP-2 as a Drug Target in Breast Cancer Drugs and Interference Fragments of ILP-2
The invention discloses the application of ILP 2 as a drug target in breast cancer drugs and interference fragments of ILP 2. The invention clarifies that the apoptotic inhibitor protein ILP_2 and ECM1 work together, influences the growth and apoptosis of breast cancer cell MCF_7 through the ECM1_mTOR pathway, plays an active role in the growth of breast cancer cell MCF_7, provides a new drug target for inhibiting the growth of tumor cells, and discloses an ILP_2 interference fragment with good interference effect.
【技术实现步骤摘要】
ILP-2作为药物靶点在乳腺癌药物中的应用及ILP-2干扰片段
本专利技术属于生物
，尤其涉及ILP-2作为药物靶点在乳腺癌药物中的应用及一种能够敲低ILP-2表达的干扰片段siRNA-5。
技术介绍
乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤，发病率逐年增加。乳腺癌的发生、发展是多因素、多步骤的复杂过程。凋亡抑制蛋白(Inhibitorsofapoptosisprotein，IAP)过度表达会引起凋亡不足，使得细胞凋亡与增殖失衡，进而促进癌细胞生长。ILP-2是凋亡抑制蛋白IAP家族成员，在乳腺癌患者血清中高表达，可作为乳腺癌的血清标志物。细胞外基质(Extracellularmatrixprotein，ECM)是由细胞合成并分泌到胞外、分布在细胞表面或细胞之间的大分子，主要是一些多糖和蛋白或蛋白聚糖，这些分子构成复杂的网架结构，不仅是支撑组织、细胞生长的支架，还能诱导和调控细胞的黏附、生长、增殖和分化。细胞外基质蛋白1(Extracellularmatrixprotein1,ECM1)是从鼠成骨基质细胞系MN7中分离出来的一种分泌性糖蛋白，最初被命名为P85，后因该蛋白被发现存在于各种结缔组织蛋白中，与多种结缔组织蛋白关系密切，故被命名为ECM1。ECM1可通过整合素或其他细胞表面受体与细胞直接发生作用，激活黏着斑激酶(Focaladhesionkinase,FAK)/磷脂酰肌醇3激酶(Phosphatidylinositol3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(ProteinkinaseB，PKB，又称为Akt)/雷帕霉素靶蛋白(Mammaliantargetofrapamycin，mTOR)信号通路,进而引起肿瘤的发生。凋亡抑制蛋白ILP-2在疾病研究的报道中并不多见，其抑制肿瘤细胞凋亡促进其生长的分子机制尚不清楚，导致无法找到有效的药物抑制肿瘤细胞生长。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术提供了ILP-2作为药物靶点在乳腺癌药物中的应用及一种敲低ILP-2表达的干扰片段siRNA-5。本专利技术明确了凋亡抑制蛋白ILP-2与ECM1共同作用，通过ECM1-mTOR通路影响乳腺癌细胞MCF-7的生长和凋亡，在乳腺癌细胞MCF-7的生长中起着积极的作用，为抑制肿瘤细胞生长提供了新的药物靶点并公开了一种具有良好干扰效果的ILP-2干扰片段。为达到上述技术效果，本专利技术的技术方案是：一种ILP-2作为药物靶点在乳腺癌药物中的应用。进一步的改进，所述ILP-2通过控制ECM1-mTOR通路控制乳腺癌细胞的生长和凋亡。进一步的改进，所述乳腺癌细胞为MCF-7。一种ILP-2干扰片段，所述干扰片段的正向序列为SEQNO1；反向序列为SEQNO2。进一步的改进，所述干扰片段通过干扰ILP-2的表达控制ECM1-mTOR通路控制乳腺癌细胞的生长和凋亡。附图说明：图1为ECM1免疫共沉淀ILP-2偶联蛋白印迹图；图2A为siRNA-5组干扰敲低ILP-2表达后用蛋白质免疫印迹法检测ECM1-mTOR通路相关蛋白结果图；图2B为ECM1组干扰敲低ILP-2表达后用蛋白质免疫印迹法检测ECM1-mTOR通路相关蛋白结果图；图2C为FAK组干扰敲低ILP-2表达后用蛋白质免疫印迹法检测ECM1-mTOR通路相关蛋白结果图；图2D为Akt组干扰敲低ILP-2表达后用蛋白质免疫印迹法检测ECM1-mTOR通路相关蛋白结果图；图3A为ILP-2表达被干扰敲低后TUNEL标记24h荧光检测分析结果；图3B为ILP-2表达被干扰敲低后TUNEL标记48h荧光检测分析结果；图3C为ILP-2表达被干扰敲低后TUNEL标记72h荧光检测分析结果；图4为干扰敲低ILP-2表达后用CCK-8法检测细胞增殖图。具体实施方式下面通过具体实施例及附图对本专利技术做进一步的详述。先结合具体实施例及附图，来进一步阐述本专利技术。实施例1：1材料与方法1.1实验材料人类乳腺癌MCF-7细胞购于苏州齐氏生物科技有限公司(ATCC细胞库)，RPMI1640培养液基购自美国Gibco公司；胎牛血清(FBS)购自浙江天杭生物科技有限公司；青-链霉素混合液、0.25％胰酶细胞消化液购自北京索莱宝生物科技有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒、WesternBlot超敏发光液购自北京普利莱基因技术有限公司；ILP-2兔多克隆抗体购自美国Abcam公司；ECM1(IP用)兔多克隆抗体购自美国Santa公司，ECM1、FAK、Akt兔多克隆抗体购自美国AffinityBiosciences公司，Tubulin兔多克隆抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司；辣根酶标记山羊抗兔IgG(H+L)购自北京中杉金桥生物技术有限公司；Lipofectamin6000Reagent转染试剂购自上海碧云天生物技术公司；ILP-2干扰片段由广州锐博基因股份有限公司合成；CCK-8(CellCountingKit-8)法细胞增殖检测试剂盒、一步法TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒购自南京凯基生物公司。主要实验仪器有:上海博迅医疗生物仪器股份有限公司SPX-250B-Z生化培养箱、湖南凯达科学仪器有限公司TD-5A台式低速离心机、日本OLYMPUS公司BX51倒置荧光显微镜、基因有限公司EL×800酶标仪、德国eppendorf公司Centrifuge5430R低温离心机、北京市六一生物科技有限公司DYY-11型电泳仪、北京赛智创业科技有限公司MiniChmi420化学发光成像仪。1.2细胞与细胞培养人乳腺癌细胞MCF-7细胞用含10％灭活小牛血清的PRMll640培养基培养于37℃、5％CO2、95％饱和湿度的培养箱内。后续实验均取对数生长期的细胞。1.3实验分组将六孔细胞培养板每孔加入1×105个MCF-7细胞悬液，用5％灭活小牛血清且不含双抗的PRMll640培养基处理12h。待细胞汇合度为40-50％时按照Lipofectamine6000说明书转染，siRNA终浓度为50nmol/L。将转染混合物加入到如下分组的细胞中，在37℃5％CO2培养12h后换成10％完全培养基再培养24h。设置MCF-7组为空白对照组、NC(NegativeControl,NC)为阴性对照组、siRNA-3组和siRNA-5组四组。干扰片段序列见表1。表1干扰片段序列1.4免疫沉淀联合蛋白质印迹法用预冷的磷酸盐缓冲溶液(Phosphatebufferedsolution，PBS)洗MCF-7细胞2次，加300μLIP裂解液，收集细胞，冰浴30min后4℃14000rpm离心15min，取上清至新的EP(Eppendorf)管，从中取50μL总蛋白作Input，-20℃保存；向剩余蛋白液中加入20μL洗涤后的磁珠，4℃孵育1h后4℃1000rpm离心3min，取上清转移至新EP管，4℃14000rpm离心3min，磁力板吸附磁珠于EP管底部，取上清蛋白液，均分为两组，分别加入IgG(1：500)和ILP-2(1：100)抗体3ug，4℃孵育过夜。次日加入磁珠30μL/管，4℃孵育6h后收集沉淀，用500μLPBST(吐温-20含量占0.1％)洗5min×4次后用40μL磷酸盐吐温缓冲液(Phosphatebuffereds本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种ILP‑2作为药物靶点在乳腺癌药物中的应用。
【技术特征摘要】
1.一种ILP-2作为药物靶点在乳腺癌药物中的应用。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述ILP-2通过控制ECM1-mTOR通路控制乳腺癌细胞的生长和凋亡。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述乳腺癌细胞为MCF-7。4.一...
【专利技术属性】
技术研发人员：向思琦，向明钧，王雅妮，屈欢，
申请(专利权)人：吉首大学，
类型：发明
国别省市：湖南,43
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