一种豆渣和纳豆芽孢杆菌混合发酵产酶的方法技术

本发明专利技术公开了一种豆渣和纳豆芽孢杆菌混合发酵产酶的方法，它包括：将活化的纳豆芽孢杆菌，接种到豆渣培养基中；在36~38℃、摇床转速150~200rpm下发酵30~40小时，得粗酶液；盐析初步纯化，再用柱层析二次纯化；4）干燥；本发明专利技术提高了豆渣的利用率，同时液态发酵也更方便于实际工业生产，其纯化分离步骤简单；纳豆激酶粗酶液酶活可达到189.3IU/mg，α‑淀粉酶酶活可达到7.8U/mg；经过电泳试验验证纳豆激酶分子质量为29kDa，其纯化倍数可达到8.97倍，比酶活达到1663.9IU/mg；α‑淀粉酶的分子质量63kDa，其纯化倍数达到5.12倍，比酶活达到39.93U/mg。

A Method for Producing Enzyme by Mixed Fermentation of Soybean Dreg and Bacillus natto

The invention discloses a method for producing enzymes by mixed fermentation of soybean dregs and Bacillus natto, which includes: inoculating activated Bacillus natto into soybean dregs culture medium; fermenting for 30-40 hours at 36-38 C and 150-200 RPM in shaking table to obtain crude enzymes solution; preliminary purification by salting-out and secondary purification by column chromatography; 4) drying; improving the utilization rate of soybean dregs while liquid-state production. Fermentation is also more convenient for industrial production, and its purification and separation steps are simple; the crude enzyme activity of nattokinase can reach 189.3IU/mg, and the activity of alpha amylase can reach 7.8U/mg; the molecular weight of nattokinase can reach 8.97 times, and the specific activity can reach 1633.9IU/mg; the molecular weight of alpha amylase 63 kDa can reach 5.12 times. The specific enzyme activity reached 39.93U/mg.

【技术实现步骤摘要】
一种豆渣和纳豆芽孢杆菌混合发酵产酶的方法
本专利技术属微生物发酵
，具体涉及一种豆渣和纳豆芽孢杆菌混合发酵产酶的方法。
技术介绍
随着我国农业加工业的快速发展，农副产物也随之大量产生。据悉中国每年大豆总产量约为1400~1500万吨，其所产湿豆渣约为5000多万吨。由于其含水量大，可溶性差且口感粗糙，大部分豆渣都被遗弃或用作动物饲料。但豆渣中仍含有大量的营养物质如碳水化合物、蛋白质、纤维素等。面对严重的资源浪费问题，越来越多的学者开始对豆渣的改性进行研究。其中包括物理方法(低温超微粉碎、超临界萃取等)、化学方法（酸碱法、离子液体法）和生物方法(酶解法、发酵法)。其中微生物发酵方法优点众多，其既可以避免化学方法带来的副作用又可以比物理方法更节约成本。微生物发酵除了在豆渣的营养特性和物理性质上会有一些改变外，还能够生产高附加值产品。纳豆芽孢杆菌(Bacillusnatto)，属于枯草芽孢杆菌的一个亚种，属于革兰氏阳性杆菌，在其生长过程中可能够分解大分子物质，同时可产生多种营养和活性成分以及分泌多种胞外酶，如纳豆激酶，淀粉酶等。纳豆激酶是一种具有溶栓性的丝氨酸蛋白酶，其包含275个氨基酸、分子量大概在27.3~35.0kDa、等电点8.6、在pH5.5~9.0具有较好的稳定性。相对于医学上尿激酶、链激酶等药剂，其具有生产成本低、安全性高的优势。纳豆激酶具有安全性高、成本低、生产工艺简单、口服有效期和体内半衰期长等特点，是非常有前景的新一代溶栓性药物。目前，纳豆激酶的生产主要还是通过对大豆的发酵，但近几年越来越多的学者采用不同底物进行发酵生产纳豆激酶，如木豆、红豆、鹰嘴豆、蚕豆等也可作为培养基生产纳豆激酶。同时农副产物用于生产纳豆激酶提高其附加值的研究也越来越广泛，尤其是粮食与油脂副产物作为培养基应用最为广泛。纳豆激酶的开发主要问题集中于菌种筛选、发酵培养基及条件的优化、基因工程改良和提取纯化等四个方面。纳豆激酶的生产主要是通过固态发酵，但由于液态发酵低成本及简便性也越来越多的被应用。在提高酶活性方面，主要是有选择发酵底物和发酵条件的优化两种方法。α-淀粉酶来源十分广泛，可源于动物、植物、微生物。虽然其来源不同，但其主要作用都是分解淀粉、多糖或糖原的内部的α-1,4糖苷键，最终产生麦芽糖、葡萄糖、短链糊精等低分子糖。由于其在分解过程中淀粉的粘度会急剧下降，因此也被称为液化酶。目前，α-淀粉酶制剂制备最为简单有效的方法就是通过微生物发酵的方法来生产，发酵的方法包括深层发酵和固态发酵。其主要发酵菌种包括两类，一类是枯草杆菌(BacilusSubtilis)，另一类是霉菌如黄曲霉(Aspergillustamari)、黑曲霉(Aspergillusniger)等。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种豆渣和纳豆芽孢杆菌混合发酵产酶的方法。一种豆渣和纳豆芽孢杆菌混合发酵产酶的方法，它包括：1）接种：将活化的纳豆芽孢杆菌，按接种量3~10%接种到豆渣培养基中；2）发酵：在36~38℃、摇床转速150~200rpm下发酵30~40小时，得粗酶液；3）分离纯化：盐析初步纯化，再用柱层析二次纯化；4）干燥；步骤1）所述的豆渣培养基是重量比为1:3~6的豆渣和水混合，灭菌；步骤1）所述的接种量为9%；步骤1）所述的活化，是纳豆芽孢杆菌菌液按照3%的接种量接入配制好的LB培养基中，在37℃下、以120rpm摇床培养12h后，将培养基于9500rpm/min的高速冷冻离心机中离心10min，制得菌泥，并用无菌水来重新溶解，调整菌液浓度在107cfu/mL；步骤2）所述的发酵，在37℃、摇床转速170rpm下发酵36h；步骤3）所述的盐析，用70%硫酸铵盐析；所述的柱层析，用葡聚糖凝胶柱层析；步骤4）所述的干燥为喷雾干燥。本专利技术提供了一种豆渣和纳豆芽孢杆菌混合发酵产酶的方法，它包括：1）接种：将活化的纳豆芽孢杆菌，按接种量3~10%接种到豆渣培养基中；2）发酵：在36~38℃、摇床转速150~200rpm下发酵30~40小时，得粗酶液；3）分离纯化：盐析初步纯化，再用柱层析二次纯化；4）干燥；本专利技术提高了豆渣的利用率，同时液态发酵也更方便于实际工业生产，其纯化分离步骤简单；发酵后的纳豆激酶粗酶液酶活可达到189.3IU/mg，α-淀粉酶酶活可达到7.8U/mg；经过电泳试验验证纳豆激酶分子质量为29kDa，其纯化倍数可达到8.97倍，比酶活达到1663.9IU/mg；α-淀粉酶的分子质量63kDa，其纯化倍数达到5.12倍，比酶活达到39.93U/mg。附图说明图1产酶种类鉴定结果；图2不同培养基在不同时间段纳豆芽孢杆菌活菌数及酶活力的变化结果；图3不同培养基产酶趋势的SDS-PAGE验证试验结果；图4发酵时间对纳豆激酶和α-淀粉酶酶活性的影响；图5接种量对纳豆激酶和α-淀粉酶酶活性的影响；图6固液比对纳豆激酶和α-淀粉酶酶活性的影响；图7摇床转速对纳豆激酶和α-淀粉酶酶活性的影响；图8发酵温度对纳豆激酶和α-淀粉酶酶活性的影响；图9不同浓度硫酸铵对纳豆激酶和α-淀粉酶酶活性的影响；图10SephadexG-200凝胶层析图谱；图11SDS-PAGE和Native-PAGE的分析结果。具体实施方式实施例1培养基的制备1、豆渣淀粉混合培养基：可溶性淀粉2g，琼脂粉8g，豆渣10g，去离子水1000mL，pH7.0~7.2，121℃灭菌20min；2、豆渣酪蛋白混合培养基：琼脂粉20g，干酪素3g，豆渣10g，去离子水1000mL，pH7.0~7.2，121℃灭菌20min；3、羧甲基纤维素钠豆渣混合培养基：羧甲基纤维素钠10g，琼脂粉8g，豆渣10g，去离子水1000mL，pH7.0~7.2，121℃灭菌20min；4、玉米豆粕培养基：玉米粉80g，豆粕40g，磷酸氢二钠8g，硫酸铵4g，氯化钙2g，氯化铵1.5g，去离子水1000mL，pH7.0-7.2，121℃灭菌20min；5、LB培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，葡萄糖10g，去离子水1000mL，pH7.2~7.4，121℃灭菌20min。实施例2菌种的活化将实验室保藏的纳豆芽孢杆菌菌液按照3%的接种量接入配制好的LB培养基中进行活化，其经过在预设温度37℃的摇床中以120rpm培养12h后，将培养基于9500rpm/min的高速冷冻离心机中离心10min，制得菌泥，并用无菌水来重新溶解，调整菌液浓度在107cfu/mL作为发酵剂。实施例3纳豆芽孢杆菌发酵豆渣产酶鉴定参照孙妍等《产蛋白酶和纤维素酶纳豆芽孢杆菌益生菌株的筛选及其生长特性研究》的方法，对纳豆芽孢杆菌发酵豆渣产酶进行鉴定；首先将活化后的纳豆芽孢杆菌菌悬液分别接种在打好孔的豆渣淀粉混合培养基平板，豆渣酪蛋白混合培养基平板，纤维素钠豆渣混合培养基平板中，然后将其放置在37℃恒温培养箱中培养24h；然后将豆渣淀粉混合培养基用碘液进行媒染，若培养基中圆孔周围未变蓝，则说明豆渣可促进该纳豆芽孢杆菌产生α-淀粉酶将淀粉分解；将豆渣酪蛋白混合培养基用福林酚试剂进行媒染，若培养基上出现透明圈，则证明豆渣可促进纳豆芽孢杆菌产生蛋白酶活性将蛋白分解；将羧甲基纤维素钠豆渣混合培养基先用0.2%的刚果红染色30mi本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种豆渣和纳豆芽孢杆菌混合发酵产酶的方法，它包括：1）接种：将活化的纳豆芽孢杆菌，按接种量3~10%接种到豆渣培养基中；2）发酵：在36~38℃、摇床转速150~200rpm下发酵30~40小时，得粗酶液；3）分离纯化：盐析初步纯化，再用柱层析二次纯化；4）干燥。

【技术特征摘要】
1.一种豆渣和纳豆芽孢杆菌混合发酵产酶的方法，它包括：1）接种：将活化的纳豆芽孢杆菌，按接种量3~10%接种到豆渣培养基中；2）发酵：在36~38℃、摇床转速150~200rpm下发酵30~40小时，得粗酶液；3）分离纯化：盐析初步纯化，再用柱层析二次纯化；4）干燥。2.根据权利要求1所述的一种豆渣和纳豆芽孢杆菌混合发酵产酶的方法，其特征在于：步骤1）所述的豆渣培养基是重量比为1:3~6的豆渣和水混合，灭菌。3.根据权利要求2所述的一种豆渣和纳豆芽孢杆菌混合发酵产酶的方法，其特征在于：步骤1）所述的接种量为9%。4.根据权利要求3所述的一种豆渣和纳豆芽孢杆菌混合发酵产酶的方法，其特征在于：步骤1）所述的活化，是纳豆芽孢杆菌菌液按...

【专利技术属性】
技术研发人员：朴春红，邓淑心，胡洋，杨玉莹，崔阳，张媛媛，王玉华，于寒松，刘俊梅，代伟长，
申请(专利权)人：吉林农业大学，
类型：发明
国别省市：吉林,22