In one aspect, methods of cell treatment are disclosed, which include making cells pass through holes of membranes including multiple holes while exposing the cells to reagents to cause changes in the cells, thereby allowing the reagents to enter the cells, each of which extends from an input opening to an output opening and has at least one diameter smaller than the cell. Section size, and the largest section size in many embodiments. For example, at least one cross-sectional size of the hole and the maximum cross-sectional size of the hole in many embodiments may be less than about 40 microns, or less than about 30 microns, or less than about 20 microns, or less than about 15 microns, or less than about 10 microns.
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】基于多孔膜的大分子递送系统相关申请的交叉引用本申请要求2016年9月28日提交的美国临时申请号62/401,053的优先权,该申请的内容通过引用以其全文结合在此。
本专利技术总体上涉及用于处理细胞的系统和方法,并且更具体地涉及允许操纵细胞以使细胞能够从外部环境摄取试剂(例如,生物剂)的此类系统和方法。
技术介绍
各种治疗和诊断应用需要使细胞摄取多种试剂(例如,生物剂)。在许多情况下,这些试剂无法透过细胞,并因此试剂向细胞中的递送带来了巨大挑战。举例来说,基因编辑技术需要将基因编辑组分递送到细胞中。一种这样的基因编辑技术,通常被称为CRISPR(规律成簇间隔短回文重复),需要将核糖核蛋白(RNP)复合物递送至细胞。然而,此类RNP复合物跨细胞膜递送是困难的。已经开发了许多技术来促进将外来试剂递送至细胞。此类技术的一些实例包括电穿孔,光穿孔,通过纳米针的直接穿刺等。然而,这些技术可能存在许多缺点。例如,这些技术可以表现出低效率和/或低细胞活力。在一些情况下,此类技术需要使用特殊缓冲液。而且,许多这样的技术不适合于大量细胞的平行处理。因此,存在用于将试剂递送至细胞中的经改进的系统和方法的需要。
技术实现思路
在一个方面,披露了用于细胞处理的方法,该方法包括使多个细胞通过包含多个孔的膜的一个或多个孔,同时将这些细胞暴露于试剂以引起这些细胞的变化,从而允许所述试剂进入这些细胞中的至少一个,其中所述孔中的每一个从输入开口延伸到输出开口,并且具有在约7微米至约9微米的范围内,并且优选地在约8微米至约9微米的范围内的最大截面尺寸。在一些实施例中,每个孔的最大截面尺寸是约7微米 ...
【技术保护点】
1.一种用于细胞处理的方法,所述方法包括:使多个细胞穿过包含多个孔的膜的一个或多个孔,同时将这些细胞暴露于试剂以引起这些细胞的变化,从而允许所述试剂进入这些细胞中的至少一个;其中所述孔中的每一个从输入开口延伸至输出开口,并且具有在约7微米至约9微米的范围内的最大截面尺寸。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.09.28 US 62/401,0531.一种用于细胞处理的方法,所述方法包括:使多个细胞穿过包含多个孔的膜的一个或多个孔,同时将这些细胞暴露于试剂以引起这些细胞的变化,从而允许所述试剂进入这些细胞中的至少一个;其中所述孔中的每一个从输入开口延伸至输出开口,并且具有在约7微米至约9微米的范围内的最大截面尺寸。2.如权利要求1所述的方法,其中所述最大截面尺寸在约8微米至约9微米的范围内,并且其中任选地所述最大截面尺寸为约7微米,并且其中任选地所述最大截面尺寸为约8微米,并且其中任选地所述最大截面尺寸为约9微米。3.如权利要求1或2中任一项所述的方法,其中所述细胞是循环细胞。4.如权利要求1-3中任一项所述的方法,其中所述循环细胞选自由以下组成的组:CD34+细胞、祖细胞、诱导多能干细胞(iPSC)、以及造血干细胞和祖细胞(HSPC)。5.如权利要求1-4中任一项所述的方法,其中所述循环细胞选自由以下组成的组:免疫效应细胞、CD3+细胞、T细胞和NK细胞。6.如权利要求1-5中任一项所述的方法,其中所述循环细胞被工程化以表达嵌合抗原受体(CAR)。7.如权利要求1-5中任一项所述的方法,其中所述循环细胞能够被工程化以表达嵌合抗原受体(CAR)。8.如权利要求1-7中任一项所述的方法,其中所述孔具有在约7微米至约10微米的范围内的长度。9.如权利要求1-7中任一项所述的方法,其中所述孔具有在约18微米至约21微米的范围内的长度。10.如权利要求1-9中任一项所述的方法,其中所述膜具有在约7mm2至约80mm2的范围内的活性表面积。11.如权利要求1-10中任一项所述的方法,其中所述膜具有在约1x105至约2x106个孔/cm2的范围内的表面孔密度。12.如权利要求1-7中任一项所述的方法,其中将这些细胞和所述试剂置于液体载体中,并且通过向所述液体载体施加压力来推动所述液体载体穿过所述孔。13.如权利要求12所述的方法,其中所述液体载体中所述细胞的浓度在约10,000至约200,000个细胞/微升的范围内,并且其中任选地所述细胞的浓度在约50,000至约200,000个细胞/微升的范围内,并且其中任选地所述细胞的浓度在约100,000至约200,000个细胞/微升的范围内,并且其中任选地所述细胞的浓度在约150,000至约200,000个细胞/微升的范围内。14.如权利要求12或13中任一项所述的方法,其中向所述液体载体施加的所述压力使得所述细胞以至少约10mL至约20mL(毫升)/分钟的速率穿过所述孔。15.如权利要求12-14中任一项所述的方法,其中向所述液体载体施加的所述压力在约5psi至约20psi的范围内。16.如权利要求12-15中任一项所述的方法,其中所述液体载体包含水、基础细胞培养基、无血清培养基、造血干细胞布鲁(HSCbrew)培养基、一种或多种细胞因子、一种或多种生长因子、一种或多种活力增强剂、聚乙二醇(PEG)、清洁剂、膜稳定剂中的任一种及其组合,并且任选地其中所述一种或多种活力增强剂是UM171、SR1、((S)-2-(6-(2-(lH-吲哚-3-基)乙氨基)-2-(5-氟吡啶-3-基)-9H-嘌呤-9-基)丙-l-醇中的任一种,及其组合。17.如权利要求16所述的方法,其中所述一种或多种细胞因子选自由以下组成的组:血小板生成素(TPO)、Flt3配体(Flt-3L)、干细胞因子(SCF)、白细胞介素-6(IL-6),及其组合。18.如权利要求1-17中任一项所述的方法,其中所述变化是瞬时变化。19.如权利要求1-18中任一项所述的方法,其中所述变化包括细胞膜渗透性的变化。20.如权利要求1-19中任一项所述的方法,其中所述膜的孔至少部分地被聚乙烯吡咯烷酮包被。21.如权利要求1-20中任一项所述的方法,其中所述试剂包含脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、质粒、核糖核蛋白复合物(RNP)、蛋白质、肽、脂质、多糖、寡糖、反义寡核苷酸、适配体、纳米颗粒、染料、不可透过膜的化合物中的任一种及其组合。22.如权利要求1-21中任一项所述的方法,其中所述试剂是基因编辑系统。23.如权利要求22所述的方法,其中所述基因编辑系统是CRISPR基因编辑系统、ZFN基因编辑系统、TALEN基因编辑系统、大范围核酸酶基因编辑系统或Cre重组酶基因编辑系统。24.如权利要求22所述的方法,其中所述基因编辑系统是CRISPR基因编辑系统。25.如权利要求24所述的方法,其中所述CRISPR基因编辑系统包含一种或多种RNP。26.如权利要求25所述的方法,其中所述RNP是Cas9-gRNA复合物。27.如权利要求22-26中任一项所述的方法,其中所述试剂包含模板核酸。28.如权利要求1-27中任一项所述的方法,其中所述试剂是通常不可透过细胞膜的化合物。29.如权利要求1-27中任一项所述的方法,其中所述试剂是带电的。30.如权利要求1-27中任一项所述的方法,其中所述试剂是电中性的。31.如权利要求1-30中任一项所述的方法,其中所述试剂具有高于约2kDa,任选地在约2kDa至约100kDa的范围内的分子量。32.如权利要求1-31中任一项所述的方法,其中所述膜包含聚合材料。33.如权利要求32所述的方法,其中所述聚合材料选自由以下组成的组:聚碳酸酯、聚四氟乙烯(PTFE)、聚苯乙烯、聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚丙烯(PP)、聚酰亚胺(PI)、环烯烃共聚物(COC)、环烯聚合物(COP)、聚酯、和聚二甲基硅氧烷(PDMS)。34.如权利要求32或33中任一项所述的方法,其中所述孔是通过离子径迹蚀刻、激光钻孔、等离子体刻蚀、或光刻法中的任一种在所述聚合材料中形成的。35.如权利要求1-31中任一项所述的方法,其中所述膜包含半导体、陶瓷、或金属中的任一种。36.如权利要求1-35中任一项所述的方法,其中所述孔沿着所述孔中每一个的长度具有基本上一致的截面面积。37.如权利要求1-35中任一项所述的方法,其中所述孔基本上是圆柱形的。38.如权利要求1-35中任一项所述的方法,其中所述孔具有规则的截面形状。39.如权利要求1-35中任一项所述的方法,其中所述孔具有不规则的截面形状。40.如权利要求38所述的方法,其中所述规则的截面形状是圆形、椭圆形和多边形形状中的任一种。41.如权利要求40所述的方法,其中所述多边形形状选自由以下组成的组:正方形、矩形、六边形、和八边形形状。42.如权利要求1-41中任一项所述的方法,其中所述孔具有疏水性内表面。43.如权利要求1-42中任一项所述的方法,其中所述孔具有亲水性内表面。44.如权利要求1-43中任一项所述的方法,所述方法进一步包括在使细胞穿过膜的步...
【专利技术属性】
技术研发人员:F·法金,M·菲奥里诺,C·李,Y·杨,J·延,
申请(专利权)人:诺华股份有限公司,
类型:发明
国别省市:瑞士,CH
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