基于DNA纳米自主装对沙门菌invA基因检测的方法技术

技术编号:21267664 阅读:24 留言:0更新日期:2019-06-06 04:34
本发明专利技术提供一种基于DNA纳米自主装对沙门菌invA基因检测的方法,该方法选用沙门菌高度保守的invA基因,设计与其特异性结合的探针,结合DNA自组装技术,基于其信号放大作用,利用比色技术检测沙门菌invA基因。本发明专利技术以茎环DNA(H0)为模板,通过与靶核酸结合(与部分环状模板互补)打开H0,随后与H1、H2发生连续杂交反应,最终形成大量含有富G序列的复合体,在催化反应体系(Hemin、ABTS

Detection of Salmonella invA Gene Based on DNA Nano-self-assembly

The invention provides a method for detecting invA gene of Salmonella based on DNA nano-self-assembly. The method selects highly conserved invA gene of Salmonella, designs a probe with specific binding, combines DNA self-assembly technology, and uses colorimetric technology to detect invA gene of Salmonella based on its signal amplification. The present invention uses stem ring DNA (H0) as template, opens H0 by binding with target nucleic acid (complementary to partial ring template), and then successively hybridizes with H1 and H2, finally forms a large number of complex containing rich G sequence, in the catalytic reaction system (Hemin, ABTS).

【技术实现步骤摘要】
基于DNA纳米自主装对沙门菌invA基因检测的方法
本专利技术属于生物检测领域,具体涉及一种基于DNA纳米自主装对沙门菌invA基因检测的方法。
技术介绍
沙门氏菌属肠杆菌科,是革兰阴性肠道杆菌,它是食源性疾病中最重要的致病菌之一。沙门氏菌感染后主要引起食物中毒、胃肠炎、伤寒和副伤寒。有研究表明,沙门氏菌的侵袭蛋白与其致病性密切相关,决定着细菌进入宿主上皮细胞的能力。它主要由一系列基因编码,其中invA是编码沙门菌侵染上皮细胞表面蛋白的基因,与该菌致病性密切相关,是沙门菌特有的。目前,最常用的肠道致病菌检测方法主要有三种:传统的分离培养鉴定、酶联免疫吸附法(ELISA)和聚合酶链式反应(PCR)。传统的分离培养鉴定法是将细菌分离培养后通过菌落计数和菌落形态、染色特征、生化反应等方法对细菌进行鉴定,该方法是细菌鉴定的金标准方法,但是其耗时费力。ELISA方法是基于抗原抗体反应的免疫学检测,与传统的分离培养鉴定方法相比较,缩短了检测时间,但是仍然需要细菌培养这一步,至少需要24~48小时才能得出准确的结果,而且该方法的检测限一般为≥105CFUmL-1,难以满足低浓度细菌的检测。PCR技术与上述两种方法相比较,优点是较高的灵敏度,但是PCR结果容易出现假阳性;目前实验室主要用凝胶电泳技术来检测PCR扩增的片段,但是凝胶电泳技术的分辨率较低且需要较高精确度的热循环仪,因此限制了PCR技术在实验室检测细菌的广泛运用。另一方法,不使用热循环仪的核酸依赖的扩增(NASBA)和自主序列复制系统(ASR),在特异性上又大打折扣,主要是由于必须用一个相对较低的温度40℃来进行扩增。链置换扩增术(SDA)利用四种引物在等温条件下扩增,很大程度上克服了这些缺陷,但是仍然存在薄弱的环节:必须利用昂贵的修饰核苷酸作为底物来进行扩增反应。
技术实现思路
为了解决现有技术中的问题,本专利技术的目的在于提供一种基于DNA纳米自主装对沙门菌invA基因检测的方法,该方法用于沙门菌invA基因检测灵敏度高、特异性好,且操作简单,适合大规模推广。本专利技术的目的是这样实现的:一种基于DNA纳米自主装对沙门菌invA基因检测的方法,包括信号放大反应体系和催化反应体系,其特征在于:所述信号放大反应体系中包括针对沙门菌invA基因的茎环模板H0、扩增反应辅助茎环模板H1和H2、缓冲体系;所述茎环模板H0的序列如SEQIDNO:1所示,所述辅助茎环模板H1的序列如SEQIDNO:2所示,所述辅助茎环模板H2的序列如SEQIDNO:3所示。SEQIDNO:1(茎环模板H0),5’-TGGCAGCCCTTTCTCAATGCGGATTCCCAGTTGAGTGTGAGAAAGG-3’;SEQIDNO:2(辅助茎环模板H1),5’-GGGTAGGGCGGGTTGGGATGAGAAAGGGCTGCCACATCCCAACCCATA-3’;SEQIDNO:3(辅助茎环模板H2):5’-TATGGGTTGGGATGTGGCAGCCATCCCAAC-3’。检测原理:本专利技术使用DNA纳米自组装技术对沙门菌invA基因检测,采用特定的茎环模板(H0)以实现对沙门菌invA基因的高特异性的识别,通过DNA自组装核酸等温反应,及DNAzyme信号放大实现对痕量沙门菌invA基因高灵敏的检测,检测原理示意图如图1所示。具体的,茎环模板(H0)含有特异设计的a*片段,与沙门菌invA基因a完全互补。当沙门菌invA基因a存在时,与茎环模板(H0)中的a*片段结合形成复合物1并将茎环打开。H0被a打开后,暴露出事先封闭的b,c片段,可进一步与辅助茎环模板(H1)中的b*,c*片段发生特异性杂交反应并将辅助茎环模板H1打开。H1被打开后,暴露出辅助茎环模板(H1)中的d,c*片段,可进一步与辅助茎环模板(H2)发生特异性杂交反应并打开H2,并将复合物1通过链置换反应置换掉。被置换掉的复合物1随后可继续与H1发生反应,循环往复。辅助茎环模板(H1)中的e,f片段(富GDNA片段)便可游离出来。功能核酸GDNA是一段富含鸟嘌呤的核苷酸,当与Hemin结合后具有类似于辣根过氧化物酶的活性,最后体系中的GDNA催化底物ABTS2-进行显色反应,通过紫外分光光度计测得其在418nm处的吸光度变化实现对沙门菌invA基因的检测。在一个实施方案中,本专利技术信号放大反应体系中,所述缓冲体系选自TNaKbuffer。所述催化反应体系包括Hemin、ABTS2-和H2O2。在一个实施方案中,本专利技术信号放大反应体系中,所述茎环模板(H0)终浓度为50~150nM,最佳为100nM。所述辅助茎环模板(H1)终浓度为75~175nM,最佳为125nM。在一个实施方案中,本专利技术反应体系的温度为4~55℃,优选37℃。本专利技术DNA自组装反应时间为10~40min,优选20min。有益效果本专利技术提供一种基于DNA纳米自主装对沙门菌invA基因检测的方法,该方法选用沙门菌高度保守的invA基因,设计与其特异性结合的探针,结合DNA自组装技术,基于其信号放大作用,利用比色技术形成比色传感器检测沙门菌invA基因。本专利技术以茎环DNA(H0)为模板,通过与靶核酸结合(与部分环状模板互补)打开H0,随后与H1、H2发生连续杂交反应,最终形成大量含有富G序列的复合体,在催化反应体系(Hemin、ABTS2-和H2O2)下发生颜色变化。本专利技术对沙门菌invA基因检测灵敏度高、特异性好,检测的线性范围达到50pM~200nM,灵敏度为:32pM。本专利技术检测方法不需要昂贵的仪器设备,具有检测简便快速、灵敏度高、检测成本低和现场检测等特点,适合大规模推广。附图说明图1是检测原理示意图;图2是DNA自组装反应中所涉及到的各元件及DNA自组装产物用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行验证图;图3是对DNA自组装反应中所涉及到的各元件及DNA自组装产物用紫外分光光度计进行验证图;图4是不同浓度H0构建沙门菌invA基因比色传感器的紫外检测图;图5是不同浓度H1构建沙门菌invA基因比色传感器的紫外检测图;图6是不同温度的反应缓冲体系紫外检测图;图7是不同反应时间的反应缓冲体系紫外检测图;图8是不同浓度的沙门菌invA基因的吸光度变化图;图9是沙门菌invA基因的线性方程图。实施例为了使本专利技术的目的和技术方案更加清楚,下面对本专利技术的优选实施例进行详细的描述。要说明的是:以下实施例只用于对本专利技术进行进一步的说明,而不能理解为对本专利技术保护范围的限制。本领域的技术人员根据本专利技术的上述内容做出的一些非本质的改进和调整均属于本专利技术的保护范围。本专利技术所用原料与试剂均为市售产品。实施例1提取用作PCR模板的基因组DNA由于沙门菌感染很多是食源性的,因此通常可以用食品或者粪便作为检测源。用食品检测:在无菌条件下进行操作,将待检食品放入匀浆机中搅成匀浆,取25g(或mL)待检样品的匀浆用225mL缓冲蛋白胨水(BP)稀释成1∶10的均质匀浆液。取1mL均质匀浆液置于离心管中,12000r/min离心5min,灭菌生理盐水洗涤2次,最后用0.25mL蒸馏水悬浮,置于100℃水浴中孵育15分钟然后立即置于冰中。在4℃以12000r/min离心10分钟后,将上清液转移至新管中本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种基于DNA纳米自主装对沙门菌invA基因检测的方法,包括信号放大反应体系和催化反应体系,其特征在于:所述信号放大反应体系中包括针对沙门菌invA基因的茎环模板H0、扩增反应辅助茎环模板H1和H2、缓冲体系;所述茎环模板H0的序列如SEQ ID NO:1所示;所述辅助茎环模板H1的序列如SEQ ID NO:2所示;所述辅助茎环模板H2的序列如SEQ ID NO:3所示。

【技术特征摘要】
1.一种基于DNA纳米自主装对沙门菌invA基因检测的方法,包括信号放大反应体系和催化反应体系,其特征在于:所述信号放大反应体系中包括针对沙门菌invA基因的茎环模板H0、扩增反应辅助茎环模板H1和H2、缓冲体系;所述茎环模板H0的序列如SEQIDNO:1所示;所述辅助茎环模板H1的序列如SEQIDNO:2所示;所述辅助茎环模板H2的序列如SEQIDNO:3所示。2.如权利要求1所述的方法,其特征在于:所述缓冲体系选自TNaKbuffer。3.如权利要求2所述的方法,其特征在于:所述催化反应体系包括Hemin、ABTS2-和H2O...

【专利技术属性】
技术研发人员:徐红兵丁世家杨玉妮
申请(专利权)人:重庆医科大学
类型:发明
国别省市:重庆,50

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