一种编码牙鲆胞外ATP水解酶CD39的cDNA全长序列及其应用制造技术

本发明专利技术公开了牙鲆胞外ATP水解酶CD39基因的检测方法及其对鱼类天然免疫的调节作用。本发明专利技术通过以不同物种CD39基因编码区序列的保守区设计简并引物，经反转录及PCR扩增，结合RACE技术最终得到牙鲆CD39的全长cDNA序列。牙鲆CD39蛋白是一种重要的胞外ATP水解酶，其通过控制细胞外ATP浓度，对鱼类胞外ATP介导的天然免疫应答起重要调节作用。本研究为鱼类天然免疫调控的分子机制研究提供了新的证据，亦可为针对鱼类CD39蛋白的免疫功能调节剂研发奠定重要基础。

Full-length cDNA Sequence Encoding Extracellular ATP Hydrolase CD39 of Paralichthys olivaceus and Its Application

The invention discloses a method for detecting the extracellular ATP hydrolase CD39 gene of flounder and its regulating effect on the natural immunity of fish. The present invention designs degenerate primers based on conservative regions of CD39 gene coding region sequences of different species, amplifies them by reverse transcription and PCR, and finally obtains the full-length CD39 gene sequence of Paralichthys olivaceus by combining RACE technology. CD39 protein is an important extracellular ATP hydrolase, which plays an important role in regulating the innate immune response mediated by extracellular ATP in fish by controlling the concentration of extracellular ATP. This study provides new evidence for the study of the molecular mechanism of fish innate immune regulation, and lays an important foundation for the research and development of immunomodulators targeting fish CD39 protein.

【技术实现步骤摘要】
一种编码牙鲆胞外ATP水解酶CD39的cDNA全长序列及其应用
本专利技术涉及生物学领域，具体是牙鲆胞外ATP水解酶CD39基因全长cDNA序列及其编码的蛋白，以及该基因的克隆和应用。
技术介绍
近年来，随着人民生活水平的日益提高，鱼类作为一种高蛋白低脂肪的食物受到人们越来越多的亲睐。由于水产养殖规模在世界范围内不断扩大，国内外水产品贸易及水产苗种跨区域交流的日益频繁，水产养殖动物病原传播的机会大大增加。此外，由于现代水产养殖业的高度集约化和高密度生产特点，导致渔业水域环境恶化和水体细菌大量繁殖，引发养殖动物应激反应，导致机体免疫系统受到抑制。上述内外因素的相互作用，导致世界范围内水产养殖动物疾病爆发趋于频繁，流行范围趋于广泛，从而给养殖业带来了极大的经济损失。通过运用现代生物学技术作为水产养殖的技术支撑，对经济动物病害进行免疫防治是水产动物疾病防治的重要手段。因此，近年来鱼类免疫学研究在国际上受到了越来越多的重视。鱼类和哺乳动物的免疫系统具有一定的保守性。为了适应水体环境，鱼类演化出自身特有的免疫特性，具有天然免疫和获得性免疫应答两个系统，但其获得性免疫系统并不完善，因此，天然（先天）免疫在鱼类免疫系统中扮演着更重要的作用。研究表明，机械损伤、免疫刺激、细胞坏死、细胞凋亡及病原侵染等条件下，细胞可通过胞吐、离子通道的方式将ATP从细胞内迅速释放到细胞外。胞外ATP是一种可以激活宿主天然免疫应答的强效促炎症信号分子，其通过作用于细胞膜表面P2嘌呤受体或ATP激活的离子通道，触发不同的下游信号（如Ca2+信号、环腺苷酸信号和蛋白激酶信号等），形成嘌呤免疫信号通路，广泛参与了机体的天然免疫应答调控。然而，过高的胞外ATP浓度可以诱导细胞产生过度的天然免疫反应，对机体产生不利影响。因此，胞外ATP的浓度必须受到严格控制。通过胞外核苷酸酶水解胞外ATP，从而降低胞外ATP的可利用浓度，将胞外ATP的促炎症效应维持在适度水平，是维持机体免疫稳态的重要途径。胞外二三磷酸核苷酸水解酶I（ecto-nucleosidetriphosphatediphosphohydrolase，e-NTPDase），亦称为CD39，是一种广泛分布于植物、动物等真核生物中，分子量约为70~100kD、定位于细胞膜上的糖蛋白。CD39是嘌呤免疫信号通路的重要组成成员，其主要作用是水解ATP和ADP，形成AMP，后者再由5'胞外核苷酸酶（CD73）水解为腺苷，进而将胞外ATP的促炎症效应转化为抗炎症效应，以维持机体适度、有效的免疫应答。CD39对机体天然免疫应答起重要调节作用。研究表明，CD39可以调节胞外ATP受体P2X7介导的细胞凋亡及促炎性细胞因子IL-1β和IL-8的释放；CD39还可以将TLR受体诱导释放的胞外ATP迅速水解为腺苷，进而减弱巨噬细胞的活化程度；此外，过表达CD39有助于呼吸道上皮细胞抵抗绿脓假单胞菌侵染。牙鲆（Paralichthysolivaceus）属碟形目、牙鲆科、牙鲆属，俗称“比目鱼”、“左口”，是我国以及东亚地区主要的海水养殖鱼类，具有较高的经济价值。随着近年来养殖规模的不断扩大，病毒、细菌等病原体导致的流行性病害在集约化养殖条件下爆发日趋频繁，对牙鲆养殖业造成了严重的经济损失，严重制约了牙鲆养殖业的健康可持续发展。目前，由于对于牙鲆免疫调控分子机理了解较少，致使相关免疫防治技术的开发与应用受到严重的制约。细胞外ATP是一种重要的、具有强效免疫刺激功能的内源性信号分子，其在活化鱼天然免疫应答过程中起着重要作用。虽然适度的免疫应答对于病原清除和维持机体稳态具有重要作用，但过度的天然免疫应答则会造成机体损伤、坏死，甚至导致个体死亡。因此，分离鉴定具有调节鱼类天然免疫应答强度的功能基因，有助于深入理解和控制胞外ATP在鱼类天然免疫中的作用。胞外二三磷酸核苷水解酶1（CD39）是胞外ATP免疫信号通路上游的关键调节基因，与机体内的许多炎症反应与免疫反应有着密切的关系，可以在一定程度上反映鱼类的免疫能力。分离鉴定牙鲆胞外CD39基因，有助于深入解析CD39结构与功能的关系及其与鱼类免疫应答的关联，加深人们对鱼类精细而复杂的免疫应答过程的全面认识，从而为寻找诊断、预防和治疗鱼类流行性疾病提供新的策略，并为鱼类分子抗病育种设计、抗病性转基因鱼的设计、鱼类基因疫苗设计等提供重要的理论基础。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种牙鲆胞外核苷酸酶CD39的cDNA序列及克隆方法。该牙鲆胞外ATP水解酶CD39基因cDNA序列，基因cDNA全长1685bp，含有1494bp的开放阅读框，具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列；其编码497个氨基酸，具有SEQIDNO.2所示的氨基酸序列。本专利技术还公开了用于检测牙鲆胞外ATP水解酶CD39基因cDNA序列的特异性引物，其特征在于：正向引物：5’－CCTTCCGACTCTACGGTAATGAC-3’SEQIDNO.3反向引物：5’-GGATCTGATATGGATACTGGACCT-3’SEQIDNO.4。本专利技术更加详细的描述如下：本专利技术采用的技术方案是通过以不同物种CD39基因的CDS序列保守区设计简并引物，通过RT-PCR反转录及PCR扩增，结合RACE技术获得牙鲆CD39基因cDNA的全长表达序列；牙鲆CD39基因全长cDNA共1685bp，包括开放阅读框为1494bp，共编码497个氨基酸，含有114bp的5'非翻译区，77bp的3'非翻译区及poly(A)尾巴。这些基因结构特征可以说明所得的cDNA序列为牙鲆CD39基因的全长cDNA序列。牙鲆CD39基因编码的蛋白质分子量为55.3KDa，等电点为8.58,与其它物种的CD39蛋白有82%-99%的序列相似性。本专利技术进一步公开了牙鲆胞外核苷酸酶CD39基因序列在作为牙鲆疾病防治靶标基因方面的应用，以及在作为牙鲆疾病实时荧光RT-PCR检测方面的应用，还有其对牙鲆天然免疫调控方面的应用。本专利技术更进一步公开了牙鲆胞外核苷酸酶CD39基因cDNA序列克隆方法，其特征是包括如下主要步骤：（1）健康牙鲆解剖分离头肾组织：选取健康牙鲆,于水族箱中暂养3天后处死,解剖分离头肾组织。（2）总RNA的提取和纯化：采用Trizol法从牙鲆头肾中提取得到牙鲆头肾总RNA。总RNA纯化采用DNA酶处理法。(3)牙鲆CD39基因cDNA中间片段的克隆测序：(3.1)cDNA第一链的合成以纯化的牙鲆头肾总RNA作为模板，以Oligo(dT)16作为反转录引物，进行cDNA第一链合成，得到cDNA第一链，作为下述PCR扩增的cDNA模板。(3.2)PCR扩增采用巢式PCR方法进行扩增反应。以前述所得的cDNA第一链为模板，利用下述第一引物进行PCR扩增：正向引物：5’－GSGATTGTYRYCHTGGTRWC-3’反向引物：5’-AARAYMCCRTTGAADGARCA-3’扩增得到牙鲆胞外核苷酸酶CD39基因cDNA中间片段，通过克隆测序，得到中间片段序列。本步骤中，扩增体系可优选如下：扩增程序参数可优选为：94℃4min；94℃30sec，52℃30sec，72℃1min（30个循环）；72℃5min；12℃保温。(4)牙鲆CD39基因cD本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.牙鲆胞外ATP水解酶CD39基因cDNA序列，该基因cDNA全长1685bp，含有1494bp的开放阅读框，具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；其编码497个氨基酸，具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
1.牙鲆胞外ATP水解酶CD39基因cDNA序列，该基因cDNA全长1685bp，含有1494bp的开放阅读框，具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列；其编码497个氨基酸，具有SEQIDNO.2所示的氨基酸序列。2.权利要求1所述牙鲆胞外ATP水解酶CD39基因序列在制备作为牙鲆疾病防治靶标基因方面的应用。3.权利要求1所述牙鲆胞外ATP水解酶CD39基因序列在制备作为牙鲆疾病...

【专利技术属性】
技术研发人员：李硕，孙金生，陈晓丽，李佳芳，
申请(专利权)人：天津师范大学，
类型：发明
国别省市：天津,12