一种用于细胞非靶向代谢组学分析的样品前处理方法技术

本发明专利技术公开了一种用于细胞非靶向代谢组学分析的样品前处理方法，属于化学分析检测领域。本发明专利技术提供了一种目的是提供一种细胞代谢组学分析的前处理方法，所述方法包括如下步骤：(1)利用淬灭液对细胞进行淬灭，然后收集细胞；所述淬灭液为甲醇和水的混合溶液；(2)步骤(1)得到的细胞中加入提取液进行提取；所述提取液为乙腈、异丙醇和无菌水的混合溶液。采用本发明专利技术的前处理方法处理样品所得的代谢物峰数据丰富，代谢物数量均达190以上，丰度较高均在60×10

A Sample Pretreatment Method for Cell Non-Targeted Metabonomics Analysis

The invention discloses a sample pretreatment method for cell non-targeted metabonomics analysis, which belongs to the field of chemical analysis and detection. The present invention provides a pretreatment method for cell metabonomics analysis. The method comprises the following steps: (1) quenching cells with a quenching solution and collecting cells; the quenching solution is a mixture of methanol and water; (2) adding extract to the obtained cells for extraction; and the extract is a mixture of acetonitrile, isopropanol and sterile water. Combine solution. The metabolite peak data obtained by the pretreatment method of the present invention are abundant, the number of metabolites is more than 190, and the abundance is higher than 60*10.

【技术实现步骤摘要】
一种用于细胞非靶向代谢组学分析的样品前处理方法
本专利技术涉及一种用于细胞非靶向代谢组学分析的样品前处理方法，属于化学分析检测领域。
技术介绍
细胞代谢组学(Metabonomics/mebabolomics)在生物学研究上具有重大意义。代谢组学是研究生物体系在受到外界不同刺激或干扰(基因改造或外部环境变化等)前后等特定条件下的代谢产物(分子量<1000)的种类、数量和变化规律的科学，能够分析机体局部的一条代谢通路，是一种新型的系统生物学重要组成部分。代谢组学与其它组学相比，可以从代谢物层面上对生命活动进行探究，通过分析内源性代谢物的调节以及与整体生物学状况的关系，找出生物标记物，从而找出外界环境对引起生物体变化的可能途径。目前，细胞代谢组学已由一个充满假想的概念演变成发展迅速、研究价值巨大的学术领域，并拥有广阔的市场前景。现在细胞代谢组学已经在许多不同的领域得到了应用，如毒理学研究、临床诊断、兴奋剂等药物滥用检测、药效评价、有机物环境监测分析、细胞培养监测、生物制药生产、生物利用度和药代动力学研究中的应用、生物大分子的研究、农药残留的检测、食品组学等。在上述这些领域中所有的分析基础都是胞内的代谢物，所以，如何高效的提取胞内的代谢物是根本所在，是所有代谢分析实验的基石。同时，高通量的代谢组学研究要求检测分析技术具有高灵敏度、高分辨率、无偏性和良好的重现性。气相色谱质谱联用仪(GC-MS)是基于质谱的主要检测平台之一，是代谢组学研究中应用最早的分析技术，也是最为成熟的色谱-质谱联用技术之一，具有分离能力强、分辨率高、灵敏度高、重现性好、有较高的分析速度、标准代谢物图库丰富等优点，在分析相对分子质量小、极性和沸点低的代谢物或衍生化后在具有挥发性的物质有明显优势。此外，GC-MS仪器相对便宜，且有较为完整的人体代谢质谱数据库(HMDB)，物质鉴定起来相对便捷，尤其适用于分析多组分混合物中未知成分的定性分析，可准确判断化合物的分子式，能够鉴别甚至未分离的色谱峰。但目前基于GC-MS分析的细胞代谢组学样本前处理方法通用性不强，缺少对方法的优化，提取不够充分，难以实现高通量全范围的检测分析。在对药物筛选、毒理评价等研究时，对于性质或者含量差异较大的物质难以实现同步检测，提取的选择性较低。因此，优化一种基于GC-MS检测的细胞非靶向代谢组学的样本前处理方法，将为科研人员研究以细胞为模型的代谢组学分析提供方便。
技术实现思路
本专利技术主要侧重于细胞基于GC-MS的代谢组学分析的样品前处理的代谢物的提取效率，解决现有技术中提取效率低下，代谢物提取不完全这一技术难题。本专利技术通过优化细胞数量、淬灭、收集、提取、衍生化方式等，得到一种代谢物提取充分、通用性强、提取效率高、重现性好的基于GC-MS代谢组学分析的细胞代谢组学样品预处理方法。本专利技术的第一个目的是提供一种细胞代谢组学分析的前处理方法，所述方法包括：(1)利用淬灭液对细胞进行淬灭，然后收集细胞；所述淬灭液为甲醇和水的混合溶液；(2)步骤(1)得到的细胞中加入提取液进行提取；所述提取液为乙腈、异丙醇和无菌水的混合溶液。在本专利技术的一种实施例中，所述提取液中乙腈、异丙醇和超纯水的体积比为(1～3)：(1～3)：1。在本专利技术的一种实施例中，所述甲氧胺盐酸盐与N,O-双(三甲基硅)三氟乙酰胺的质量比为1：(5-8)。在本专利技术的一种实施例中，所述淬灭液中甲醇和水的体积比为(1～3)：1。在本专利技术的一种实施例中，所述淬灭方法包括将淬灭液与细胞混合进行猝灭，细胞与淬灭液的体积比为1：1～1：4。在本专利技术的一种实施例中，所述提取方法包括在提取体系中加入钢珠组织进行破碎，然后超声辅助提取。在本专利技术的一种实施例中，所述细胞代谢产物提取方法具体包括：将细胞放于冰上，加入-20℃预冷的提取液；加入钢珠于离心管中，置于组织破碎机中进行细胞破碎、超声辅助提取；用吸铁石吸出钢珠、离心；取上清液，多次重复，合并上清液。在本专利技术的一种实施例中，所述提取液与细胞的体积比为1：1～1：4。在本专利技术的一种实施例中，所述破碎机是在1200～1800rpm，20～40s，6～9cycle条件下进行细胞破碎。在本专利技术的一种实施例中，所述钢珠直径1～3mm。在本专利技术的一种实施例中，所述无菌水用高温高压蒸汽灭菌锅121℃，20min灭菌得到。在本专利技术的一种实施例中，所述淬灭方法具体包括：细胞放于冰上，吸取胞外培养液，用4℃预冷的PBS清洗细胞培养皿2-3次，加入-20℃预冷的淬灭液淬灭细胞。将甲醇和无菌水按照(1～3)：1的体积比混合得到淬灭液，预冷至-20℃以下使用，然后与细胞混合进行淬灭。在本专利技术的一种实施例中，所述收集细胞是用细胞刮刀将细胞刮下，吸入1.5mLEppendorf离心管中，1000g，5min离心，弃上清，收集细胞。在本专利技术的一种实施例中，所述方法还包括细胞的培养、代谢提取物的保存。在本专利技术的一种实施例中，所述细胞的培养包括在含10％灭活胎牛血清的DMEM培养液中培养，以血球计数板对细胞计数，实验细胞数量至少达到1×107。在本专利技术的一种实施例中，所述代谢提取物的保存包括在-80℃环境下储存1-7d，优选6d。在本专利技术的一种实施例中，所述方法还包括衍生化。在本专利技术的一种实施例中，所述衍生化包括在70-90℃环境下，先加入甲氧胺盐酸盐(MeOX)溶液，然后加入含三甲基氯硅烷的N,O-双(三甲基硅)三氟乙酰胺(BSTFA)溶液。在本专利技术的一种实施例中，所述三甲基氯硅烷的添加量为N,O-双(三甲基硅)三氟乙酰胺质量的0.5％-1.5％。在本专利技术的一种实施例中，所述方法具体包括：(1)细胞数量：细胞呈贴壁生长，用含10％灭活胎牛血清的DMEM培养液在37℃、5％CO2条件下培养,采用0.25％胰酶消化，每3d按1:3的比例传代1次，取对数生长期的细胞用于实验；血球计数板对细胞计数，实验细胞数量至少达到1×107；(2)细胞淬灭方式：细胞放于冰上，吸取胞外培养液，用1mL4℃预冷的PBS清洗细胞培养皿2-3次，加入-20℃预冷的淬灭液(3:2甲醇：水)1mL淬灭细胞；(3)细胞收集方式：用细胞刮刀将细胞刮下，吸入1.5mLEppendorf离心管中，1000g，5min离心，弃上清，收集细胞；(4)胞内代谢物提取：将步骤(3)得到的细胞样品加入配制好的-20℃预冷提取溶液，Eppendorf离心管中加入2-3粒钢珠，组织破碎机振荡破碎，然后超声辅助提取1-5min，12000rpm/min离心2min，上层清液转移至另一离心管中。重复上述步骤提取2次，合并滤液，真空冷冻浓缩得到提取样品；-80℃保存，待用；(5)细胞代谢物衍生化：步骤(4)所得代谢组提取物质中加入80μL配制浓度为20mg/mL的甲氧胺盐酸盐(MeOX)溶液，旋涡振荡使其混合均匀，样品置于烘箱中80℃孵育60min；冷却至室温，加入100μL含1％三甲基氯硅烷的N,O-双(三甲基硅)三氟乙酰胺(BSTFA)溶液，旋涡混合后继续置于烘箱中75℃孵育90min。衍生化结束后取溶液150μL于装有衬管的色谱进样小瓶装，待进样分析；(6)细胞代谢物衍生化后储存及上机：步骤(5)中所得细胞代谢物立即进行GC-MS系统分析检测或者-80℃储存1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种细胞代谢组学分析的前处理方法，其特征在于，所述方法包括：(1)利用淬灭液对细胞进行淬灭，然后收集细胞；所述淬灭液为甲醇和水的混合溶液；(2)步骤(1)得到的细胞中加入提取液进行提取；所述提取液为乙腈、异丙醇和无菌水的混合溶液。

【技术特征摘要】
1.一种细胞代谢组学分析的前处理方法，其特征在于，所述方法包括：(1)利用淬灭液对细胞进行淬灭，然后收集细胞；所述淬灭液为甲醇和水的混合溶液；(2)步骤(1)得到的细胞中加入提取液进行提取；所述提取液为乙腈、异丙醇和无菌水的混合溶液。2.根据权利要求1所述的前处理方法，其特征在于，所述提取液中乙腈、异丙醇和超纯水的体积比为(1～3)：(1～3)：1。3.根据权利要求1或2所述的前处理方法，其特征在于，所述淬灭液中甲醇和水的体积比为(1～3)：1。4.根据权利要求1所述的前处理方法，其特征在于，所述淬灭方法包括将淬灭液与细胞混合进行猝灭，细胞与淬灭液的体积比为1：1～1：4。5.根据权利要求1-4任一所述的前处理方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙秀兰，崔方超，纪剑，孙嘉笛，皮付伟，张银志，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32