一种基于[Ru(bpy)3]制造技术

本发明专利技术涉及一种基于新型纳米多孔材料Ru(bpy)3

A new method based on [Ru(bpy)3]

The invention relates to a novel nanoporous material Ru(bpy)3.

【技术实现步骤摘要】
一种基于[Ru(bpy)3]2+/Au@NiFeMOFs的免疫传感器的制备方法
本专利技术涉及一种基于Ru(bpy)32+/Au@NiFeMOFs的竞争型电致化学发光免疫传感器的制备方法及应用。具体涉及纳米材料Ru(bpy)32+/Au@NiFeMOFs和氨基功能化的介孔二氧化硅MSN的制备及其在电致化学发光传感器中的应用。利用MSN优良的生物兼容性、大的比表面积、高的孔隙率作为基底材料增加抗体和发光材料Ru(bpy)32+/Au@NiFeMOFs的固载量来达到增强传感器光信号输出的目的。本专利技术属于电化学发光检测

技术介绍
从阿尔茨海默症（AD）患者脑内的细胞质基质中分离出来的β-淀粉样蛋白（Aβ）可溶性寡聚物已经被证明可以损害海马突出可塑性、减少突触、诱导tau蛋白过度磷酸化，还会引起神经性营养不良、激活小胶质细胞炎症、损害记忆等症状（在不存在淀粉样斑块的情况下）。AD作为一种进行性不可逆神经系统疾病，严重威胁着人类的健康，大大降低了许多中老年人的生活质量。经过对AD患者大量的科学研究，Aβ由于其具有非常强的神经毒性被认为是AD发病机制的关键，因此被选作诊断AD的生物标志物和治疗靶点。然而寻找一种可以简便快捷灵敏的Aβ检测方法有着重要意义。电化学发光方法消耗低、容易控制、灵敏度高且检测限低，具有电化学和化学发光两种方法的优势，是一种环境友好型方法。因此本专利技术设计了一种竞争型的电致化学发光免疫分析方法用于早期AD患者脑内细胞质基质Aβ的检测。在本专利技术中，首次使用一种新型纳米多孔材料Ru(bpy)32+/Au@NiFeMOFs作为电化学发光材料并引入到电化学发光领域。Au@NiFeMOFs表面带有许多负电荷又因其多孔性具有较大的比表面积可以负载更多的Ru(bpy)32+阳离子，进而增强传感器的发光强度来提高其灵敏度。氨基功能化的介孔二氧化硅MSN由于其较大的比表面积被作为传感器基底材料，可以捕获更多的Aβ抗体增加传感器的灵敏度。本专利技术的原理是基于单独Aβ和其抗体的结合能力大大强于Ru(bpy)32+/Au@NiFeMOFs标记的Aβ，随着单独Aβ溶液浓度的变大，和抗体结合的Ru(bpy)32+/Au@NiFeMOFs标记Aβ就越少，发光强度减弱。此外，本专利技术设计的竞争型免疫传感器也为其它蛋白质毒素的检测提供了一种新方法。目前基于Ru(bpy)32+/Au@NiFeMOFs构建竞争型免疫传感器来检测Aβ的方法还未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种更简单可靠的基于Ru(bpy)32+/Au@NiFeMOFs的电致化学发光免疫传感器的制备方法和应用，实现对蛋白质毒素Aβ的快速、灵敏、特异、高效检测。本专利技术的技术方案如下：为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：1.介孔二氧化硅MSN、纳米多孔材料Ru(bpy)32+/Au@NiFeMOFs标记Aβ抗原孵化物溶液的制备（1）介孔二氧化硅MSN的制备将0.5mL~1.5mL、1mol/L的氢氧化钠溶液加入30mL超纯水80℃搅拌20min，加入3mg~5mg十六烷基三甲基溴化铵，继续搅拌30min，降至室温，加入2mL~3mL硅酸四乙酯，搅拌4h，继续加入500μL~1mL硅酸四乙酯和乙醇1：10的混合溶液搅拌4h，离心分离悬浮物，使用盐酸和甲醇1:1混合液洗涤3次，乙醇洗涤2次，35℃真空干燥，得到白色固体介孔二氧化硅；将30mg~50mg介孔二氧化硅分散在50mL无水乙醇，加入200μL3-氨丙基三乙氧基硅烷，70℃~90℃回流12h，超纯水洗涤，35℃真空干燥，得到氨基功能化的介孔二氧化硅MSN；（2）Ru(bpy)32+/Au@NiFeMOFs的制备将140mg~160mg六水合氯化镍和260mg~280mg二水合柠檬酸三钠分散于20mL超纯水中磁力搅拌5min，同样将130mg~150mg的铁氰化钾分散于20mL超纯水中磁力搅拌5min，然后将两种溶液混合继续在室温下搅拌8h~12h，离心分离悬浮物，使用超纯水和乙醇分别洗涤2次，35℃真空干燥，得到土黄色纳米多孔NiFeMOFs；将30mg~50mg纳米多孔NiFeMOFs分散在50mL超纯水中，加入1mL~3mL、1%~3%的氯金酸溶液，室温下搅拌5min，加入4mg~6mg聚乙烯吡咯烷酮抑制金纳米粒子的团聚，然后加入70mg~90mg还原剂柠檬酸三钠，0.5mg~1mg硼氢化钠，室温下搅拌8h~12h，溶液慢慢变成紫黑色，离心分离悬浮物，超纯水洗涤至上清液无色，35℃真空干燥12h，得到紫黑色固体Au@NiFeMOFs；将40mg~60mg纳米多孔Au@NiFeMOFs分散在30mL超纯水中，加入6mg~10mg三联吡啶氯化钌六水合物，室温下搅拌8h~12h，由于Au纳米粒子和NiFeMOFs表面都带有大量负电荷可以和发光体Ru(bpy)32+阳离子通过静电吸附结合而形成稳定的Ru(bpy)32+/Au@NiFeMOFs复合物，离心分离悬浮物，超纯水洗涤至上清液无色，35℃真空干燥12h，得到红棕色固体Ru(bpy)32+/Au@NiFeMOFs；（3）Ru(bpy)32+/Au@NiFeMOFs标记Aβ孵化物溶液的制备将6mg~10mg的Ru(bpy)32+/Au@NiFeMOFs分散于1mLpH7.5的PBS中，加入4μL~6μL、6mg/mL的Aβ，4℃恒温振荡培养箱中振荡孵化12h~24h，4℃离心分离洗去未结合的Aβ，然后加入1mL0.1%的牛血清白蛋白溶液4℃恒温振荡培养箱中振荡孵化2h~4h封闭Ru(bpy)32+/Au@NiFeMOFs表面的非特异性活性位点，4℃离心分离洗去未结合的牛血清白蛋白，最后分散于pH7.5的PBS缓冲溶液中，制得0.5mg/mL~5mg/mL的Ru(bpy)32+/Au@NiFeMOFs标记Aβ溶液，储存于4℃中备用。2.一种Ru(bpy)32+/Au@NiFeMOFs的竞争型电致化学发光传感器的制备方法，包括以下步骤：（1）分别用1.0mm、0.3mm、0.05mm的氧化铝抛光粉对直径4mm的玻碳电极做抛光处理，用超纯水冲洗干净；（2）将6µL、0.5mg/mL~5mg/mL介孔硅MSN纳米材料水溶液滴涂至电极表面，室温下晾干；（3）将3μL、0.5%~1.5%戊二醛溶液滴于电极表面连接介孔硅MSN和抗体，用pH7.5的PBS缓冲溶液冲洗电极表面，晾干；（4）将6μL、8μg/mL~12μg/mL的Aβ抗体溶液孵化滴涂到电极表面，用pH7.5的PBS缓冲溶液冲洗，4℃晾干；（5）将2μL~4μL体积分数为0.5%的牛血清白蛋白溶液滴涂到电极表面，以封闭电极表面上非特异性活性位点，用pH7.5的PBS缓冲溶液冲洗，4℃晾干；（6）将6μL、一定浓度的Aβ溶液滴加到电极表面，用pH7.5的PBS缓冲溶液冲洗，4℃晾干；（7）将6μL、0.5mg/mL~5mg/mL的Ru(bpy)32+/Au@NiFeMOFs标记Aβ溶液滴加到电极表面，4℃晾干，用pH7.5的PBS缓冲溶液冲洗，制得一种基于Ru(bpy)32+/Au@NiFeMOFs的竞争型电致化学发光免疫传感器。3.电致化学发光传感器用于待测样品的电化学发光检测：（1）使用本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于Ru(bpy)3

【技术特征摘要】
1.一种基于Ru(bpy)32+/Au@NiFeMOFs的竞争型电致化学发光免疫传感器的制备方法及应用，其特征在于，步骤如下：（1）介孔二氧化硅MSN的制备将0.5mL~1.5mL、1mol/L的氢氧化钠溶液加入30mL超纯水80℃搅拌20min，加入3mg~5mg十六烷基三甲基溴化铵，继续搅拌30min，降至室温，加入2mL~3mL硅酸四乙酯，搅拌4h，继续加入500μL~1mL硅酸四乙酯和乙醇1：10的混合溶液搅拌4h，离心分离悬浮物，使用盐酸和甲醇1:1混合液洗涤3次，乙醇洗涤2次，35℃真空干燥，得到白色固体介孔二氧化硅；将30mg~50mg介孔二氧化硅分散在50mL无水乙醇，加入200μL3-氨丙基三乙氧基硅烷，70℃~90℃回流12h，超纯水洗涤，35℃真空干燥，得到氨基功能化的介孔二氧化硅MSN；（2）Ru(bpy)32+/Au@NiFeMOFs的制备将140mg~160mg六水合氯化镍和260mg~280mg二水合柠檬酸三钠分散于20mL超纯水中磁力搅拌5min，同样将130mg~150mg的铁氰化钾分散于20mL超纯水中磁力搅拌5min，然后将两种溶液混合继续在室温下搅拌8h~12h，离心分离悬浮物，使用超纯水和乙醇分别洗涤2次，35℃真空干燥，得到土黄色纳米多孔NiFeMOFs；将30mg~50mg纳米多孔NiFeMOFs分散在50mL超纯水中，加入1mL~3mL、1%~3%的氯金酸溶液，室温下搅拌5min，加入4mg~6mg聚乙烯吡咯烷酮抑制金纳米粒子的团聚，然后加入70mg~90mg还原剂柠檬酸三钠，0.5mg~1mg硼氢化钠室温下搅拌8h~12h，溶液慢慢变成紫黑色，离心分离悬浮物，超纯水洗涤至上清液无色，35℃真空干燥12h，得到紫黑色固体Au@NiFeMOFs；将40mg~60mg纳米多孔Au@NiFeMOFs分散在30mL超纯水中，加入6mg~10mg三联吡啶氯化钌六水合物，室温下搅拌8h~12h，由于Au纳米粒子和NiFeMOFs表面都带有大量负电荷可以和发光体Ru(bpy)32+阳离子通过静电吸附结合而形成稳定的Ru(bpy)32+/Au@NiFeMOFs复合物，离心分离悬浮物，超纯水洗涤至上清液无色，35℃真空干燥12h，得到红棕色固体Ru(bpy)32+/Au@NiFeMOFs；（3）Ru(bpy)32+/Au@NiFeMOFs标记β-淀粉样蛋白孵化物溶液的制备将6mg~10mg的Ru(bpy)32+/Au@NiFeMOFs分散于1mLpH=7.5的PBS中，加入4...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵冠辉，曹伟，王耀光，李小建，东雪，苗俊聪，魏琴，
申请(专利权)人：济南大学，
类型：发明
国别省市：山东,37