一种结核分枝杆菌耐药性检测方法技术

本发明专利技术属于生物技术技术领域，具体的说是一种结核分枝杆菌耐药性检测方法，该方法包括如下步骤：裂解结核分枝杆菌用于PCR反应的模板；设计PCR引物，扩增全长的吡嗪酰胺酶(pncA)基因；浓缩扩增的pncA基因片段并定量；采用小麦胚芽无细胞表达系统表达pncA酶；测定表达的pncA酶转化吡嗪酰胺为吡嗪酸的活性，并与同样表达的结核杆菌标准敏感株和耐药株的pncA酶活性比较，测定结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性；本发明专利技术通过使用一对引物就能测定因pncA基因突变导致的耐药性；同时公开了即能从结核杆菌基因组上扩增全长pncA基因又适合小麦胚芽无细胞表达系统表达吡嗪酰胺酶的引物序列；进而实现快速、灵敏检测结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性，且无需细菌培养。

A Method for Detecting Drug Resistance of Mycobacterium Tuberculosis

The invention belongs to the field of biotechnology, in particular to a method for detecting drug resistance of Mycobacterium tuberculosis. The method comprises the following steps: splitting the template of Mycobacterium tuberculosis for PCR reaction; designing PCR primers to amplify the full-length pyrazinamidase (pncA) gene; concentrating and quantifying the amplified pncA gene fragment; expressing pncA enzyme by wheat germ acellular expression system; The activity of pncA enzymes transforming pyrazinamide into pyrazinic acid was determined, and the resistance of Mycobacterium tuberculosis to pyrazinamide was determined by comparing the activity of pncA enzymes of standard sensitive strains and drug-resistant strains of Mycobacterium tuberculosis with the same expression. The method can determine the resistance of Mycobacterium tuberculosis to pyrazinamide caused by mutation of pncA gene by using a pair of primers. Because it is suitable for wheat germ acellular expression system to express pyrazinamidase primer sequence, and thus achieve rapid and sensitive detection of Mycobacterium tuberculosis pyrazinamide resistance, without the need for bacterial culture.

【技术实现步骤摘要】
一种结核分枝杆菌耐药性检测方法
本专利技术属于生物技术
，具体的说是一种结核分枝杆菌耐药性检测方法。
技术介绍
结核病是对人类威胁最大的传染病之一，尽管牛型结核分枝杆菌疫苗(BCG)和各种抗结核药物在全球范围内得到了广泛应用，但近年来，随着人口流动及人口密度的增高，结核杆菌多重耐药菌株及同人体免疫缺陷病毒(HIV)双重感染的出现，结核病已在发达国家和发展中国家呈再度肆虐态势。据报道，2005年全球大约有880万新发结核病人，每年约有160万人死于结核病。由于结核病的历史悠久，结核病的耐药状况十分严重，多重耐药和超级耐药株的出现，已成为结核病治疗中的一个难题。结核杆菌的耐药性检测，对于指导临床正确用药和有效控制结核病具有非常重要的作用。由于结核分枝杆菌的生长十分缓慢，传统的药敏试验需要长达1～2个月时间，不能及时指导临床用药，可能使感染耐药结核的病人在该期间得不到正确的治疗。因此，快速，灵敏，特异检测结核杆菌耐药性的方法对结核病的早期诊断、有效化疗和控制传播都有极其重要的意义。在目前使用的用于治疗结核病的临床药物中，吡嗪酰胺是一线抗结核药物之一。目前临床上检测吡嗪酰胺的耐药性方法主要可以分为表型检测(细菌培养)和基因检测两类，并以前者为主。由于结核菌生长缓慢，不仅需要长达1～2个月时间，而且对吡嗪酰胺的耐药性检测需要在酸性培养基中进行，对培养基的pH值控制要求高，往往导致即使是同一实验室不同时间测定的结果也不一致。而基因检测的方法主要是测定与吡嗪酰胺耐药性产生密切相关的吡嗪酰胺酶基因(pncA)的位点突变。已报道的方法有基因芯片、基因测序列等方法。所有基因检测方法只能根据已经报道的与耐药性产生有相关性的突变位点来判断是否耐药。但是由于pncA基因的很多位点突变，都会导致吡嗪酰胺耐药性的产生，而且新的突变位点也在不断报道，因此，各种基因检测的结果容易产生假阴性，只能作为参考，还需要传统药敏实验进行验证。一系列的研究表明，吡嗪酰胺耐药性产生与结核pncA基因表达的吡嗪酰胺酶的活性丧失有90％以上的相关性，因此也有人报道通过直接测定结核分枝杆菌的吡嗪酰胺酶活性来测定结核杆菌的吡嗪酰胺耐药性。但由于结核杆菌中吡嗪酰胺酶的含量少，该方法同样需要对结核杆菌进行培养放大后才能进行，需要的时间与传统的药敏时间差不多。基于以上的原因，目前国际上还没有标准的测定结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性的方法。体外蛋白质无细胞表达系统是一种以外源DNA为模板,利用细胞抽提物中的蛋白合成机器、蛋白折叠因子及其他相关酶系,通过添加氨基酸、T7聚合酶和能量物质等来实现蛋白质体外快速表达的系统。经常使用的有兔网织红血球、小麦胚芽、大肠杆菌的细胞裂解液。使用兔网织红血球表达系统，日本科学家于2001年报道过一种测定结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性的方法。由于兔网织红血球表达系统中，溶液为深红色，与吡嗪酰胺酶活性测定的反应产物颜色接近，需要对溶液进行脱色处理，增加了检测时间和成本，脱色不完全也会带来新的误差。该报道中，也采用了小麦胚芽表达系统，但效果不明显，检测灵敏度度比兔网织红血球差很多倍。此外，该报道中采用的PCR引物，由于部分与pncA基因序列重合，PCR引物覆盖了部分的pncA基因突变位点，导致需要采用至少两对引物，才能对一个结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性进行完全检测，增加了检测的复杂性和成本。
技术实现思路
为了弥补现有技术的不足，本专利技术提出的一种结核分枝杆菌耐药性检测方法。本专利技术主要用于结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性试剂的快速检测方法(PCR引物设计方法和引物序列)，本专利技术能快速(24小时)，灵敏，特异检测结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性，具有操作简便，成本低，无需细菌培养等特点。其主要技术特征在于使用一对引物就能精确测定结核分枝杆菌因pncA基因突变导致的耐药性。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：本专利技术所述的一种结核分枝杆菌耐药性检测方法，该方法包括如下步骤：S1：通过液氮低温研磨方法实现将结核分枝杆菌的菌壁破碎，释放结核分枝杆菌基因组；通过低温研磨方法使结核分枝杆菌进行裂解，能够最大限度的保证结核分枝杆菌基因组的完整性，进而快速根据该结核分枝杆菌基因组设计出PCR引物序列；S2:根据S1中裂解后的结核杆菌基因组中全长吡嗪酰胺酶基因的上下游序列设计PCR引物序列，引物序列不与吡嗪酰胺酶基因序列重叠，完整反应全长pncA基因，且PCR引物序列上同时带有适合小麦胚芽无细胞表达系统的启动子，或者同时带有启动子和增强表达子；所述的启动子的引物序列为：5'-TAATACGACTCACTATAGG-3'；所述的表达增强子的引物序列为：5'-ATACTCCCCCACAACAGCTTACAATACTCCCCCACACAGC-3'；S3:通过高速离心方法对S2中的结核杆菌基因组进行浓缩，在浓缩的过程中进行抽真空；同时通过紫外吸收法对该结核杆菌基因组进行定量处理，通过紫外线灯实现精确控制光线的强度，进而实现高精度控制用于表达吡嗪酰胺酶的基因模板量；通过高速离心的方法对结核杆菌基因组进行浓缩，一方面能够实现快速的对结核杆菌基因组进行浓缩，另一方面提高了结核杆菌基因组浓缩的纯度，进而保证定量处理时的精确度；S4:取S3中的结核杆菌基因组5-15微克植入小麦胚芽无细胞体中进行表达，表达时间为1-24小时；S5:通过分光光度计测定S4中表达的吡嗪酰胺酶转化吡嗪酰胺为吡嗪酸的活性，并与同样表达的结核分枝杆菌标准敏感株和耐药株的吡嗪酰胺酶活性比较，测定结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性；通过分光光度计能够实现快速测定出吡嗪酰胺酶活性，同时保证测定的精度较高，进而为后期更加深入的研究结核分枝杆菌的耐药性做准备；优选的，所述所述的小麦胚芽无细胞表达系统的启动子为T7启动子，增强表达子为5’端非编码区增强子和/或3’端非编码区增强子。本专利技术所述的即能从结核杆菌基因组上扩增全长pncA基因又适合小麦胚芽无细胞表达系统表达吡嗪酰胺酶的含T7启动子的引物对序列。引物对P1：上游引物序列5'-TAATACGACTCACTATAGGCCCGCCCGAACG-3'(SEQNO.1)，下游引物序列：5'-GCCGCCAACAGTTC-3'(SEQNO.2)。所述的即能从结核杆菌基因组上扩增全长pncA基因适合小麦胚芽无细胞表达系统增强表达吡嗪酰胺酶的含T7启动子和5’端非编码区增强子的引物对序列：引物对P2：列举三套包含不同5’端非编码区增强子的上游引物序列：5'-TAATACGACTCACTATAGGTATTTTTACAACAATTACCAACAACAACAAACAACAAACAACATTACAATTACTATTTACAATTACACCCGAACGTAAGGAGGACGT-3'(SEQNO.3)；或5'-TAATACGACTCACTATAGGATACTCCCCCACAACAGCTTACAATACTCCCCCACACAGCTTACAAATACTCCCCCAGTCGCCCGAACGTAAGGAGGACGT-3'(SEQNO.4)；或5'-TAATACGACTCACTATAGGGATTGTGAGCGATTTGCGTGCGTGCATCCCGCTTCACTGATCTCTTGTTAGATCTTTTTATAA本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种结核分枝杆菌耐药性检测方法，其特征在于,该方法包括如下步骤：S1：通过液氮低温研磨方法实现将结核分枝杆菌的菌壁破碎，释放结核分枝杆菌基因组；S2:根据S1中裂解后的结核杆菌基因组中全长吡嗪酰胺酶基因的上下游序列设计PCR引物序列，引物序列不与吡嗪酰胺酶基因序列重叠，完整反应全长pncA基因，且PCR引物序列上同时带有适合小麦胚芽无细胞表达系统的启动子，或者同时带有启动子和增强表达子；所述的启动子的引物序列为：5'‑TAATACGACTCACTATAGG‑3'；所述的表达增强子的引物序列为：5'‑ATACTCCCCCACAACAGCTTACAATACTCCCCCACACAGC‑3'；S3:通过高速离心方法对S2中的结核杆菌基因组进行浓缩，在浓缩的过程中进行抽真空；同时通过紫外吸收法对该结核杆菌基因组进行定量处理，通过紫外线灯实现精确控制光线的强度，进而实现高精度控制用于表达吡嗪酰胺酶的基因模板量；S4:取S3中的结核杆菌基因组5‑15微克植入小麦胚芽无细胞体中进行表达，表达时间为1‑24小时；S5:通过分光光度计测定S4中表达的吡嗪酰胺酶转化吡嗪酰胺为吡嗪酸的活性，并与同样表达的结核分枝杆菌标准敏感株和耐药株的吡嗪酰胺酶活性比较，测定结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性。...

【技术特征摘要】
1.一种结核分枝杆菌耐药性检测方法，其特征在于,该方法包括如下步骤：S1：通过液氮低温研磨方法实现将结核分枝杆菌的菌壁破碎，释放结核分枝杆菌基因组；S2:根据S1中裂解后的结核杆菌基因组中全长吡嗪酰胺酶基因的上下游序列设计PCR引物序列，引物序列不与吡嗪酰胺酶基因序列重叠，完整反应全长pncA基因，且PCR引物序列上同时带有适合小麦胚芽无细胞表达系统的启动子，或者同时带有启动子和增强表达子；所述的启动子的引物序列为：5'-TAATACGACTCACTATAGG-3'；所述的表达增强子的引物序列为：5'-ATACTCCCCCACAACAGCTTACAATACTCCCCCACACAGC-3'；S3:通过高速离心方法对S2中的结核杆菌基因组进行浓缩，在浓缩的过程中进行抽真空；同时通过紫外吸收法对该结核杆菌基因组进行定量处理，通过紫外线灯实现精确控制光线的强度，进而实现高精度控制用于表达吡嗪酰胺酶的基因模板量；S4:取S3中的结核杆菌基因组5-15微克植入小麦胚芽无细胞体中进行表达，表达时间为1-24小时；S5:通过分光光度计测定S4中表达的吡嗪酰胺酶转化吡嗪酰胺为吡嗪酸的活性，并与同样表达的结核分枝杆菌标准敏感株和耐药株的吡嗪酰胺酶活性比较，测定结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性。2.根据权利要求1所述的一种结核分枝杆菌耐药性检测方法，其特征在于：所述的小麦胚芽无细胞表达系统的启动子为T7启动子，增强表达子为5’端非编码区增强子和/或3’端非编码区增强子。3.权利要求1所述的一种结...

【专利技术属性】
技术研发人员：王晓春，邢应如，石连，
申请(专利权)人：安徽理工大学，
类型：发明
国别省市：安徽,34