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鉴定sRNA与靶mRNA编码区域的作用关系的方法及检测系统技术方案

技术编号:21168491 阅读:45 留言:0更新日期:2019-05-22 10:00
本发明专利技术属于物种基因测序技术领域,公开了一种鉴定sRNA与靶mRNA编码区域的作用关系的方法及检测系统,针对目的基因的启动子特异性设计4条特异性引物;获取pUC57质粒骨架;构建同源重组质粒;质粒提取;用提取的质粒对野生型Z.mobilis 8b进行电转化;阳性克隆验证;构建目的sRNA过表达菌株;确定作用对之间是否有相互作用。本发明专利技术提供的方法方便快捷,相比于传统的EMSA方法,操作简单;本发明专利技术基于流式细胞术的单荧光报告基因系统,能快速确定sRNA与靶基因编码区域之间是否存在相互作用关系,便于批量操作;也可以应用于除运动发酵单胞菌以外的其他物种中使用。

Method and Detection System for Identifying the Interaction between sRNA and Target RNA Encoding Region

The invention belongs to the field of species gene sequencing technology, and discloses a method and detection system for identifying the relationship between sRNA and target gene coding region. Four specific primers are designed according to the promoter specificity of the target gene; the pUC57 plasmid skeleton is obtained; the homologous recombinant plasmid is constructed; the plasmid is extracted; the wild Z. mobilis 8B is electrotransformed with the extracted plasmid; Syndrome; Construction of the target sRNA overexpression strain; Determine whether there is interaction between the action pairs. Compared with the traditional EMSA method, the method provided by the invention is convenient and fast, and the operation is simple; the single fluorescent reporter gene system based on flow cytometry can quickly determine whether there is an interaction between sRNA and target gene coding region, and is convenient for batch operation; it can also be used in other species except Zymomonas mobilis.

【技术实现步骤摘要】
鉴定sRNA与靶mRNA编码区域的作用关系的方法及检测系统
本专利技术属于物种基因测序
,尤其涉及一种鉴定sRNA与靶mRNA编码区域的作用关系的方法及检测系统。具体涉及一种基于Ptet诱导融合表达荧光报告基因opmCherry及sRNA与靶基因作用位置的检测系统及应用。
技术介绍
目前,业内常用的现有技术是这样的:随着高通量测序技术的快速发展,大量的物种基因组得以测序并给予注释,其中非编码序列中的小RNA(smallRNAs,sRNAs)作为一个在细胞生长过程中起重要作用的调控因子,也被大量发现、挖掘和鉴定。sRNAs有不同的作用模式,大多数是与靶mRNA相互作用以控制mRNA的翻译过程,还可以与蛋白质相互作用形成作用复合物或控制蛋白质含量。其中,sRNA与其靶mRNA的相互作用可能发生在5’UTR(5’un-translationalregion)非编码区域,也可能发生在编码区域(codingregion),对其相互作用位置的准确定位及相互作用的强度鉴定非常重要,有利用实现对基因表达的准确调控。但是,现有技术EMSAs(electrophoreticmobilityshiftassays)来检测sRNA-RNA的相互作用需要在体外进行,需要对RNA进行体外转录或者带上标签后进行破细胞提取,并且RNA易降解,对环境及操作要求高,在体外进行相关凝胶实验、制备探针操作繁琐,也不便于批量操作,同时聚丙烯凝胶具有一定毒性。以上这些不足给相关研究的研究造成了困难,使得相关研究进展缓慢。综上所述,现有技术存在的问题是:(1)需要在体外进行实验,实验材料不易获取。(2)RNA不稳定,在体外容易降解,对环境和实验操作要求较高。(3)EMSAs相关实验操作操作繁琐,不便于批量研究,同时不能准确定目的sRNA与其靶编码区域之间相互作用关系。解决上述技术问题的难度:(1)需要一种方便的实验材料获取方法。(2)需要一种可批量的、简易快捷、的定量检测方法。(3)需要提高实验的安全性。解决上述技术问题的意义:解决上述技术问题可以提供一种方便、快速、安全、可批量化的研究sRNA-RNA相互作用的定量方法,有利于加快相关领域的研究进展。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题,本专利技术提供了一种鉴定sRNA与靶mRNA编码区域的作用关系的方法及检测系统。本专利技术是这样实现的,一种鉴定sRNA与靶mRNA编码区域的作用关系的方法包括:步骤一,利用生物信息学方法对靶基因的启动子序列进行分析,确定启动子序列;步骤二,针对目的基因的启动子特异性设计4条特异性引物,用于扩增得到上下游同源臂;步骤三,以ZymomonasmobilisZM4gDNA为模板,分别以引物1+引物2、引物3+引物4扩增得到上下游同源臂;步骤四,用含有筛选诱导功能区的质粒作为模板,扩增得到筛选诱导功能区片段;步骤五,以pUC57质粒为模板,PCR扩增得到质粒骨架;步骤六,将上下游同源臂和筛选诱导功能区通过overlapPCR连接成目的长片段,再通过Gibson装配将长片段与pUC57质粒骨架相连;步骤七,转化后PCR验证平板上的阳性克隆,过夜培养后提取其中的质粒;步骤八,用提取的质粒对野生型Z.mobilis8b进行电转化;步骤九,待平板上长出单菌落后可进行一次划线传代培养,之后挑取单克隆进行PCR验证;将条带正确的菌株测序确认,确定序列无误后,制备感受态,用于后续实验;步骤十,将过表达目的sRNA的质粒通过上述电转化的方法转入上一步得到的opmCherry融合表达突变菌株,验证正确后即可得到体内含有目的sRNA-codingregion作用对的实验菌株;步骤十一,对得到的实验菌株采用流式细胞术进行荧光强度的测定,通过与对照组之间进行比较分析,确定作用对之间是否有相互作用。进一步,所述步骤二以Z.mobilis基因组为模板,用引物对ZMO1437US-F/R对US进行PCR扩增,用引物对ZMO1437DS-F/R对DS进行PCR扩增;引物序列为:SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6。进一步,所述步骤三以含有筛选诱导功能区的质粒为模板,用引物Psp-SPFp、mCherry(+linker)-R进行PCR扩增得到筛选诱导功能区片段,引物序列为:SEQIDNO:7、SEQIDNO:8。进一步,所述步骤四的引物序列为:SEQIDNO:10、SEQIDNO:11。进一步,所述步骤五反应体系及PCR程序为:20μL反应体系:1437US、筛选诱导功能区片段、1437DS按摩尔比1:1:1加入到反应体系中,10μL2xprimeSTARMax,补H2O至终体积20μL;PCR程序:第一步:98℃,3min,{98℃(10s),44℃(10s),72℃(10s),10个循环};第二步:直接向第一步的产物中加入引物ZMO1437US-F和ZMO1437DS-R各0.8μL(引物浓度为10mM),再按以下条件进行反应:98℃,3min,{98℃(10s),55℃(10s),72℃(10s),25个循环},72℃(2min);获得长片段和pUC57骨架后,通过Gibson装配的方法转化大肠杆菌DH5α,PCR验证平板上的阳性克隆,将验证正确的菌株过夜培养后提取其中的质粒。进一步,所述步骤八用提取的质粒对Z.mobilis8b野生型菌株进行电转化。取相应的感受态细胞于冰上,待感受态细胞融化后取50μL加入电转杯中,并在电转杯中加入1μg质粒;电转条件为1600V,25μF,200Ω;电转完毕后于RM液体培养基中于30℃复苏;复苏6-12小时的培养物于6000rpm,1min离心,除去上清;加入200μL新鲜的RM培养基,取100μL涂布于300μg/mL卡那霉素抗性平板,30℃培养2天。进一步,所述步骤十将过表达目的sRNA的质粒通过上述的电转化方法转入到opmCherry融合表达的突变菌株中,用引物p15A_seq-F、p15A_seq-R进行验证,序列为SEQIDNO:12、SEQIDNO:13。本专利技术的另一目的在于提供一种应用所述基于Ptet诱导融合表达荧光报告基因opmCherry及目的基因的检测系统的鉴定运动发酵单胞菌sRNA与靶mRNA编码区域的作用关系的方法。本专利技术的另一目的在提供一种基于Ptet诱导融合表达荧光报告基因opmCherry及目的基因的检测系统,所述基于Ptet诱导融合表达荧光报告基因opmCherry及目的基因的检测系统包括:含有目的sRNA过表达质粒的Ptet诱导荧光报告基因opmCherry和靶基因融合表达的菌株。综上所述,本专利技术的优点及积极效果为:本专利技术以运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)为模式菌株,建立了一套基于Ptet诱导融合表达荧光报告基因opmCherry及靶基因的检测系统,用于鉴定sRNA与靶mRNA编码区域的作用关系。本专利技术的检测基于流式细胞术,比传统的EMSA的方法快速方便,且检测是在细胞体内进行,可快捷定量sRNA在体内环境下的真实作用。本专利技术的检测方法方便快捷,利用荧光报告基因与靶基因的融合表达,相比于传统的EMSA方法,操作简单;基于流式细胞术的检测系统,能快速定量确定s本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种鉴定sRNA与靶mRNA编码区域的作用关系的方法,其特征在于,所述鉴定sRNA与靶mRNA编码区域的作用关系的方法包括:步骤一,利用生物信息学方法对靶基因的启动子序列进行分析,确定启动子序列;步骤二,针对目的基因的启动子特异性设计4条特异性引物,用于扩增得到上下游同源臂;步骤三,以Zymomonas mobilis ZM4 gDNA为模板,分别以引物1+引物2、引物3+引物4扩增得到上下游同源臂;步骤四,用含有筛选诱导功能区的质粒作为模板,扩增得到筛选诱导功能区片段;步骤五,以pUC57质粒为模板,PCR扩增得到质粒骨架;步骤六,将上下游同源臂和筛选诱导功能区通过overlap PCR连接成目的长片段,再通过Gibson装配将长片段与pUC57质粒骨架相连;步骤七,转化后PCR验证平板上的阳性克隆,过夜培养后提取其中的质粒;步骤八,用提取的质粒对野生型Z.mobilis 8b进行电转化;步骤九,待平板上长出单菌落后可进行一次划线传代培养,之后挑取单克隆进行PCR验证;将条带正确的菌株测序确认,确定序列无误后,制备感受态,用于后续实验;步骤十,将过表达目的sRNA的质粒通过上述电转化的方法转入上一步得到的opmCherry融合表达突变菌株,验证正确后即可得到体内含有目的sRNA‑coding region作用对的实验菌株;步骤十一,对得到的实验菌株采用流式细胞术进行荧光强度的测定,通过与对照组之间进行比较分析,确定作用对之间是否有相互作用。...

【技术特征摘要】
1.一种鉴定sRNA与靶mRNA编码区域的作用关系的方法,其特征在于,所述鉴定sRNA与靶mRNA编码区域的作用关系的方法包括:步骤一,利用生物信息学方法对靶基因的启动子序列进行分析,确定启动子序列;步骤二,针对目的基因的启动子特异性设计4条特异性引物,用于扩增得到上下游同源臂;步骤三,以ZymomonasmobilisZM4gDNA为模板,分别以引物1+引物2、引物3+引物4扩增得到上下游同源臂;步骤四,用含有筛选诱导功能区的质粒作为模板,扩增得到筛选诱导功能区片段;步骤五,以pUC57质粒为模板,PCR扩增得到质粒骨架;步骤六,将上下游同源臂和筛选诱导功能区通过overlapPCR连接成目的长片段,再通过Gibson装配将长片段与pUC57质粒骨架相连;步骤七,转化后PCR验证平板上的阳性克隆,过夜培养后提取其中的质粒;步骤八,用提取的质粒对野生型Z.mobilis8b进行电转化;步骤九,待平板上长出单菌落后可进行一次划线传代培养,之后挑取单克隆进行PCR验证;将条带正确的菌株测序确认,确定序列无误后,制备感受态,用于后续实验;步骤十,将过表达目的sRNA的质粒通过上述电转化的方法转入上一步得到的opmCherry融合表达突变菌株,验证正确后即可得到体内含有目的sRNA-codingregion作用对的实验菌株;步骤十一,对得到的实验菌株采用流式细胞术进行荧光强度的测定,通过与对照组之间进行比较分析,确定作用对之间是否有相互作用。2.如权利要求1所述的鉴定sRNA与靶mRNA编码区域的作用关系的方法,其特征在于,所述步骤二以Z.mobilis基因组为模板,用引物对ZMO1437US-F/R对US进行PCR扩增,用引物对ZMO1437DS-F/R对DS进行PCR扩增;引物序列为:SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6。3.如权利要求1所述的鉴定sRNA与靶mRNA编码区域的作用关系的方法,其特征在于,所述步骤三以含有筛选诱导功能区的质粒为模板,用引物Psp-SPFp、mCherry(+linker)-R进行PCR扩增得到筛选诱导功能区片段,引物序列为:SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9。4.如权利要求1所述的鉴定sRNA与靶mRNA编码区域的作用关系的方法,其特征在于,所述步骤四的引物序列为:SEQIDNO:10、SEQIDNO:11。5.如权利要求1所述的鉴...

【专利技术属性】
技术研发人员:杨世辉李闰霞杨永富马立新
申请(专利权)人:湖北大学
类型:发明
国别省市:湖北,42

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