一种提高青霉素生物发酵产量的方法技术

技术编号:21168450 阅读:208 留言:0更新日期:2019-05-22 09:59
本发明专利技术涉及一种提高青霉素生物发酵产量的方法。本发明专利技术揭示了青霉素发酵过程中新的调控策略,主要涉及对优化发酵过程中后期的调控,本发明专利技术的方法可以极为显著地提高青霉素生物发酵产量。

A Method for Increasing Biological Fermentation Yield of Penicillin

The invention relates to a method for improving penicillin biological fermentation yield. The invention discloses a new control strategy in the process of penicillin fermentation, which mainly relates to the control of the later stage of the optimized fermentation process. The method of the invention can significantly improve the yield of penicillin bio-fermentation.

【技术实现步骤摘要】
一种提高青霉素生物发酵产量的方法
本专利技术属于生物工程领域,更具体地,本专利技术涉及一种提高青霉素生物发酵产量的方法。
技术介绍
自1929年弗莱明首次发现青霉素,距今已有近90年历史,作为第一个被发现的β-内酰胺类抗生素,青霉素仍然发挥着极其重要的作用。2003年,β-内酰胺类抗生素的年产值已经达到了150亿美元,青霉素类产品占其中的三分之一。青霉素的工业化生产也已经进行了60多年,通过菌种改造和发酵工艺的优化,现在青霉素产率较最初发现的原始菌株提高了100000倍以上。其成本也有了大幅度降低,由最初的每十亿单位数百美元到现在的不足十美元。青霉素也由一种昂贵的珍稀化工产品变为现在廉价的大宗化工产品。青霉素的工业生产方式采用多级补料分批发酵工艺,在发酵过程中流加补入葡萄糖、苯乙酸、硫酸铵等料液,同时控制发酵体积。通过控制流加培养液的速率,维持发酵液中的葡萄糖浓度始终处于极低浓度水平,既可以保证菌体生长,同时又不会对青霉素代谢形成阻遏作用。青霉素的合成受溶解氧、溶解二氧化碳、pH、氨氮、碳源的调控,这些调控的产生不仅与搅拌、通气、培养基组分有关,更受补料方式的影响。当溶氧浓度低于5%~10%氧饱和度(0.013~0.026mmol/L)时,青霉素的合成将受到不可逆的损害。另外,青霉素合成的中间代谢物,如δ-(L-α-氨基己二酰)-L-半胱酰胺-D-缬氨酸(LLD-ACV)、异青霉素N(IPN)、6-氨基青霉烷酸(6-APA)等物质在胞内的浓度也随溶氧浓度的降低而降低。高浓度的葡萄糖显著阻遏产黄青霉合成三肽合成酶和异青霉素N合成酶而不抑制它们的活性,还会导致乙酰辅酶A合成酶失活而影响侧链前体的活化。硫酸盐作为前体氨基酸半胱氨酸的合成原料,在青霉素的生物合成中起着重要作用,但高浓度的硫酸盐在某种程度上阻遏产黄青霉的硫酸盐通透酶而影响其摄取。有研究表明,菌体的形态与其所处的微观及宏观环境密切相关,环境的改变会导致细胞形态和生理代谢发生全局性的改变。由于上述发酵过程中的种种变化,使得青霉素生物发酵的发酵时间受限,产量受限。因此,本领域需要开发进一步改进的发酵方法,以延长发酵的时间,提高发酵的产量。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种提高青霉素生物发酵产量的方法。在本专利技术的第一方面,提供一种提高青霉素生物发酵产量的方法,所述方法包括:在青霉素发酵的中后期,进行选自下组的操作:(a)在发酵进行到80~100小时的时候,排出按照体积40~60%的发酵液,补入(如一次性补入)同等体积的新鲜培养基;以及,在发酵进行到140~160小时的时候,排出按照体积15~35%的发酵液,同时补入(如一次性补入)同等体积的新鲜培养基;或(b)从发酵进行到70~90小时起,通过流加的方式补入磷酸盐溶液;以及,从发酵进行到110~130小时起,通过流加的方式补入包含磷酸盐以及金属盐的溶液,所述金属包括:Fe、Cu、Mn、Zn、Mg。在一个优选例中,步骤(a)中,在发酵进行到85~95小时的时候,排出按照体积45~55%的发酵液,补入同等体积的新鲜培养基;以及,在发酵进行到145~155小时的时候,排出按照体积20~30%的发酵液,同时补入同等体积的新鲜培养基。在另一优选例中,步骤(b)中,从发酵进行到75~85小时起,通过流加的方式补入磷酸盐溶液;以及,从发酵进行到115~125小时起,通过流加的方式补入包含磷酸盐以及金属盐的溶液,所述金属包括:Fe、Cu、Mn、Zn、Mg。在另一优选例中,所述的磷酸盐溶液包括:KH2PO415±5g/L,较佳地为15±2g/L;(NH4)H2PO48.4±2g/L,较佳地为8.4±1g/L。在另一优选例中,流加磷酸盐的速率为1±0.3g/min;较佳地,流加磷酸盐的速率为1±0.2g/L;在另一优选例中,所述的包含磷酸盐以及金属盐的溶液包括:KH2PO415±5g/L,较佳地为15±2g/L;(NH4)H2PO48.4±2g/L,较佳地为8.4±1g/L;柠檬酸·2H2O15±5g/L,较佳地为15±2g/L;FeSO4·7H2O3.5±1g/L,较佳地为3.5±0.5g/L;CuSO4·5H2O1±0.3g/L,较佳地为1±0.1g/L;MnSO41±0.3g/L,较佳地为1±0.1g/L;ZnSO4·7H2O1±0.3g/L,较佳地为1±0.1g/L;MgSO4·2H2O13±3g/L,较佳地为13±1g/L。在另一优选例中,流加包含磷酸盐以及金属盐的溶液的速率为1±0.3g/min,较佳地为1±0.2g/L。在另一优选例中,发酵培养基含有:柠檬酸,玉米浆,FeSO4·7H2O,CuSO4·5H2O,MnSO4,ZnSO4·7H2O,MgSO4·2H2O,Na2SO4,(NH4)2SO4,KH2PO4,玉米蛋白粉,CaCO3,玉米油。在另一优选例中,发酵过程的补料液含有:葡萄糖,苯乙酸、硫酸铵,氨水。在另一优选例中,采用的青霉素生产菌株是产黄青霉菌。在另一优选例中,发酵过程中,pH在6.5±0.2,温度25±1℃,罐压0.08±0.01MPa。本专利技术的其它方面由于本专利技术的公开内容,对本领域的技术人员而言是显而易见的。附图说明图1、补料分批发酵菌浓与青霉素浓度变化。其中,标准化的青霉素(penicillinG)含量是青霉素在每一时间点时的浓度/发酵过程的最高浓度。图2、不同调控策略下青霉素浓度比较。其中,标准化的青霉素(penicillinG)含量是青霉素在每一时间点时的浓度/实施例1发酵过程(传统工艺)的最高浓度。图3、不同调控策略下总青霉素产量的比较。其中,标准化的青霉素(penicillinG)总含量是青霉素在每一时间点时的总量/实施例1发酵过程(传统工艺)的最高总产量。图4、不同调控策略下青霉素比合成速率的比较。其中,标准化的qpenG含量是青霉素在每一时间点时的比产率/实施例1发酵过程(传统工艺)的最高比产率。图5、不同调控策略在不同发酵周期菌丝形态的比较。图6、传统工艺组和实验组得率对比。(A)不同调控策略中菌体对糖得率的比较;(B)不同调控策略中青霉素G对糖得率;(C)不同调控策略中青霉素G对苯乙酸得率。图7、青霉素合成途径的示意图。具体实施方式本专利技术人经过深入的研究,揭示了青霉素发酵过程中新的调控策略,主要涉及对优化发酵过程中后期的调控,本专利技术的方法可以极为显著地提高青霉素生物发酵产量的方法,青霉素产量提高约42%。如本专利技术所用,所述的“一级发酵”、“二级发酵”是指种子罐发酵。所述的“三级发酵”是以生产青霉素为目的的发酵。除非另外说明,本专利技术权利要求及说明书中所述的“发酵”、“培养”是指“三级发酵”。除非另外说明,本专利技术权利要求及说明书中各个时间点的计算以“三级发酵”起始的时间点作为起始(0小时)。青霉素作为第一个被应用的β-内酰胺类抗生素,至今仍在医疗健康领域发挥着重要作用。本专利技术人发现,在产黄青霉菌补料分批发酵中,青霉素合成速率在发酵后期并不理想。针对这一问题,本专利技术人深入地研究了发酵过程中各个时间点的菌体状态的变化以及产量变化,设计了在合适的时间点进行“减菌加料”和后期补盐的工艺优化策略,从而大大提升了青霉素发酵的有效发酵时间,大大提高了青霉素产量。同时,根据“减菌加料”本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种提高青霉素生物发酵产量的方法,其特征在于,所述方法包括:在青霉素发酵的中后期,进行选自下组的操作:(a)在发酵进行到80~100小时的时候,排出按照体积40~60%的发酵液,补入同等体积的新鲜培养基;以及,在发酵进行到140~160小时的时候,排出按照体积15~35%的发酵液,同时补入同等体积的新鲜培养基;或(b)从发酵进行到70~90小时起,通过流加的方式补入磷酸盐溶液;以及,从发酵进行到110~130小时起,通过流加的方式补入包含磷酸盐以及金属盐的溶液,所述金属包括:Fe、Cu、Mn、Zn、Mg。

【技术特征摘要】
1.一种提高青霉素生物发酵产量的方法,其特征在于,所述方法包括:在青霉素发酵的中后期,进行选自下组的操作:(a)在发酵进行到80~100小时的时候,排出按照体积40~60%的发酵液,补入同等体积的新鲜培养基;以及,在发酵进行到140~160小时的时候,排出按照体积15~35%的发酵液,同时补入同等体积的新鲜培养基;或(b)从发酵进行到70~90小时起,通过流加的方式补入磷酸盐溶液;以及,从发酵进行到110~130小时起,通过流加的方式补入包含磷酸盐以及金属盐的溶液,所述金属包括:Fe、Cu、Mn、Zn、Mg。2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(a)中,在发酵进行到85~95小时的时候,排出按照体积45~55%的发酵液,补入同等体积的新鲜培养基;以及,在发酵进行到145~155小时的时候,排出按照体积20~30%的发酵液,同时补入同等体积的新鲜培养基。3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(b)中,从发酵进行到75~85小时起,通过流加的方式补入磷酸盐溶液;以及,从发酵进行到115~125小时起,通过流加的方式补入包含磷酸盐以及金属盐的溶液,所述金属包括:Fe、Cu、Mn、Zn、Mg。4.如权利要求1或3所述的方法,其特征在于,所述的磷酸盐溶液包括:KH2PO41...

【专利技术属性】
技术研发人员:黄明志李云龙张嗣良庄英萍储炬唐文俊黎亮白成海
申请(专利权)人:华东理工大学上海国佳生化工程技术研究中心有限公司呼伦贝尔北方药业有限公司
类型:发明
国别省市:上海,31

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