一种H9N2亚型禽流感病毒疫苗候选株rHANA3的构建方法技术

一种H9N2亚型禽流感病毒疫苗候选株rHANA3的构建方法，属于禽流感疫苗研制技术领域，通过红细胞解凝试验从本实验室分离、保存的毒株中筛出三株解凝速度不同的H9N2亚型禽流感病毒，构建其NA片段的真核表达质粒，并以毒株构建HA片段表达质粒，运用8质粒拯救系统，以H1N1的内部基因为骨架，获得NA片段不同的疫苗候选株病毒，免疫鸡制备血清，挑选出血清交叉中和能力好的毒株作为疫苗候选株，本发明专利技术构建方法科学，原理清晰，通过该方法制备的疫苗抗血清可提高对Y280‑Like和F98‑Like病毒的交叉反应性以及中和效价，克服现有疫苗只能保护单一抗原型及交叉保护差的问题，大大节约了成本，为流感防控提供更为有效的工具，为研制广谱型疫苗提供了一种新方法。

Construction of a candidate vaccine strain rHANA3 of H9N2 subtype avian influenza virus

A method for constructing candidate strain rHANA3 of H9N2 subtype avian influenza virus vaccine belongs to the field of avian influenza vaccine development technology. Three strains of H9N2 subtype avian influenza virus with different decoagulation rates were screened from the strains isolated and preserved in our laboratory by erythrocyte decoagulation test. Eukaryotic expression plasmid of its NA fragment was constructed, and HA Fragment Expression plasmid was constructed from the strain, and 8 plasmid rescue system was used. Taking the internal gene of H1N1 as the skeleton, the vaccine candidate strains with different NA fragments are obtained, the chicken is immunized to prepare serum, and the strains with good cross-neutralization ability of haemorrhagic serum are selected as vaccine candidate strains. The method of constructing the vaccine antiserum is scientific and the principle is clear. The cross-reactivity and neutralization titer of the vaccine antiserum prepared by this method can be improved to Y280 Like and F98 Like viruses and overcome. Existing vaccines can only protect single antigen type and poor cross-protection, which greatly saves costs, provides a more effective tool for influenza prevention and control, and provides a new method for the development of broad-spectrum vaccines.

【技术实现步骤摘要】
一种H9N2亚型禽流感病毒疫苗候选株rHANA3的构建方法
本专利技术属于禽流感疫苗研制
，涉及一种广谱性H9N2亚型AIV反向遗传灭活疫苗的研制方法，特别是涉及一种Y280-Like、F98-LikeH9N2亚型禽流感病毒疫苗候选株rHANA3的构建方法。
技术介绍
H9N2亚型AIV引起的通常为低致病性禽流感，其本身引发的禽类死亡率较低，但由于其分布范围广泛和传播速度较快，感染后会使蛋鸡产蛋量急剧下降，肉鸡生长缓慢，降低料肉比，对家禽养殖业造成了巨大的经济损失。H9亚型AIV感染后容易导致禽类自身免疫力的急剧下降，从而出现和其他细菌或病毒的并发或继发感染导致死亡率的升高。另外，H9N2亚型AIV可以感染人，表现为轻度的流感症状，不会致人死亡。H9亚型AIV还会作为其他亚型流感病毒内部基因的供体，为新型流感病毒株的出现提供条件，引发人类流感疫情的爆发，对公共卫生安全造成潜在威胁。自2013年以来，研究者们发现目前在中国流行的H9N2亚型AIV为在人类中分离的新型H7N9和H10N8病毒提供了6个内部基因片段。疫苗免疫是预防H9N2亚型禽流感发生与传播的有效手段之一。我国自1998年来主要采用Ck/SD/6/9和Ck/SH/F/98等毒株制备的灭活疫苗对鸡群进行免疫以防控H9N2亚型禽流感。H9N2亚型AIV具有流感病毒的变异特性，其变异模式主要有两种，一种是抗原转换，变异原因是不同毒株基因片段之间发生了重配，这种基因片段间的重配可能会引起病毒基因组的改变，产生人类尚缺乏免疫力的新毒株，从而引发新病毒在人群中的暴发流行。另一种是抗原漂移，这种变异是病毒基因组自发的点突变引起的小幅度变异，当这种改变积累到一定程度或者突变氨基酸刚好改变了病毒的抗原决定簇，就会引起病毒抗原性的改变。AIV基因组中突变频率最高的是HA基因，其次是NA基因。由于H9N2毒株抗原变异速度快，目前的流行株已经表现出了与疫苗株不同的抗原特性，所以自2009年以来，H9免疫失败在免疫鸡群中时有发生，特别是2010-2013年期间，H9N2亚型流感病毒的持续变异导致H9N2亚型禽流感在我国免疫鸡群中加剧发生，病毒持续在鸡群中流行，甚至在免疫鸡群中爆发。H9N2亚型禽流感病毒的抗原多样性以及防控现状提示我们，研制交叉保护性较好的新型广谱性H9N2亚型禽流感疫苗显得十分必要。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对目前H9N2毒株抗原变异速度快，流行株已经表现出了与疫苗株不同的抗原特性，由于抗原的持续变异导致H9N2亚型禽流感近年来在我国免疫鸡群中加剧发生，病毒持续在鸡群中流行，对家禽养殖业造成巨大经济损失等不足，提出一种H9N2亚型禽流感病毒疫苗候选株rHANA3的构建方法及应用，通过该方法可提高对Y280-Like和F98-Like病毒的交叉反应性以及中和效价，克服现有疫苗只能保护单一抗原型及交叉保护差的问题，大大节约了成本，为流感防控提供更为有效的工具，为研制广谱型疫苗提供了一种新方法。本专利技术的技术方案：一种H9N2亚型禽流感病毒疫苗候选株rHANA3的构建方法，其特征在于，所述构建方法如下：(1)解凝试验筛选不同解凝速度的H9N2亚型毒株分离鉴定保存H9N2AIV：W2-17、SN、QD5、FY2014040、WJ100和YZ4作为候选株，将候选H9N2亚型禽流感病毒经2倍梯度稀释后，再加等量的1％鸡红细胞，4℃作用30min后转移至37℃中，每隔一小时记录每个病毒株的HA效价，绘制解凝曲线，分析病毒解凝速度，筛选毒株；(2)血凝试验筛选HA片段对候选毒株进行血凝试验，测定各候选H9N2亚型AIV的HA效价，选取其中血凝效价最高的病毒，构建其HA基因表达质粒；(3)HA及NA片段表达质粒的构建方法如下：(3-1)引物设计参照Hoffmann对流感病毒的8个片段设计的通用引物，设计HA及NA片段全长扩增引物；(3-2)病毒RNA的提取及cDNA反转录根据TrizolReagent试剂说明提取病毒RNA；将病毒尿囊液8000rpm离心10min取250μL加入RNase-free的离心管中；加入500μLTrizolReagent，充分混匀后，放置5min；加入200μL三氯甲烷，剧烈混匀后，13000rpm离心10min；将上步中离心上清液450μL加入新的离心管中，再加入900μL异丙醇，混匀后放入-20℃作用5min后13000rpm离心10min；弃上清，加入1mL75％DEPC水处理的乙醇，轻轻混匀，放入-20℃作用5min后13000rpm离心10min，弃上清；根据HiScript1stStrandcDNASynthesisKit反转录试剂盒说明书进行病毒cDNA的反转录；反转录好的cDNA，于-20℃保存备用；(3-3)目的片段的扩增及纯化(3-3-1)使用PhantaMaxSuper-FidelityDNAPolymerase，以病毒cDNA为模板，扩增HA及NA基因片段，25μLPCR体系如下：10×PCRbuffer/12.5μL、dNTP(10Mm)/0.5μL、上游引物(25μmol/μL)/0.5μL、下游引物(25μmol/μL)/0.5μL、高保真酶/0.5μL、DNA模板/2μL、ddH2O/8.5μL；(3-3-2)反应程序：预变性温度为95℃3min；然后以95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸1.5min，进行35个循环，最后72℃延伸10min；(3-3-3)将PCR产物通过1％琼脂糖凝胶水平电泳进行鉴定，以核酸MarkerGeneRuler1kbDNALadder为标准参照，染色后观察结果，成功扩增出了SN株HA基因片段，命名为SN-HA，以及三株病毒的NA基因片段，分别命名为NA1、NA2和NA3；(3-3-4)将PCR产物条带切下后，按照使用用凝胶纯化回收试剂盒说明进行目的片段的纯化，测定纯化产物的浓度和纯度；(3-4)目的片段与T载体的连接参照pEASY-Blunt3CloningKit和Trans1-T1感受态细胞使用说明，将其克隆至T载体，连接产物转化Trans1-T1感受态细胞，挑斑小提质粒，经EcoRI酶切鉴定阳性的质粒送金斯瑞生物工程有限公司测序验证，测序正确的质粒-20℃保存备用；(3-5)HA、NA片段及真核表达载体的酶切与连接将鉴定为阳性克隆的HA及NA质粒测定浓度后，分别用BsmBⅠ、BsaI限制性内切酶进行酶切，将pHW2000载体用BsmBⅠ酶切，酶切后产物进行琼脂糖凝胶电泳，把相应大小条带的胶块切下并胶回收，用T4连接酶将酶切后的pHW2000载体和目的产物连接，连接产物转化感受态细胞Trans1-T，于37℃培养箱培养12-14h，挑取单个菌落于15mL氨苄LB液体培养基中培养过夜，菌落PCR鉴定，将大小正确的菌液进行测序，测序结果正确后，用QIAGEN试剂盒提取质粒，测定其浓度和纯度，选取浓度在300ng/μL以上，OD260/OD280在1.8-2.0之间的质粒保存备用；(4)病毒拯救(4-1)将构建好的HA片段表达质粒pHW-SN-HA分别与构建好的不同解凝速度病毒的NA片段表达质粒pHW-NA1、pHW-NA2以及pHW-NA3组合，以PR本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.H9N2亚型禽流感病毒疫苗候选株rHANA3的构建方法，其特征在于，所述构建方法如下：(1)解凝试验筛选不同解凝速度的H9N2亚型毒株分离鉴定保存H9N2 AIV：W2‑17、SN、QD5、FY2014040、WJ100和YZ4作为候选株，将候选H9N2亚型禽流感病毒经2倍梯度稀释后，再加等量的1%鸡红细胞，4℃作用30min后转移至37℃中，每隔一小时记录每个病毒株的HA效价，绘制解凝曲线，分析病毒解凝速度，筛选毒株；(2)血凝试验筛选HA片段对候选毒株进行血凝试验，测定各候选H9N2亚型AIV的HA效价，选取其中血凝效价最高的病毒，构建其HA基因表达质粒；(3)HA及NA片段表达质粒的构建方法如下：(3‑1)引物设计参照Hoffmann对流感病毒的8个片段设计的通用引物，设计HA及NA片段全长扩增引物；(3‑2)病毒RNA的提取及cDNA反转录根据Trizol Reagent试剂说明提取病毒RNA；将病毒尿囊液8000 rpm 离心10 min取250 µL加入RNase‑free的离心管中；加入500 µL Trizol Reagent，充分混匀后，放置5 min；加入200 µL三氯甲烷，剧烈混匀后，13000 rpm离心10 min；将上步中离心上清液450 µL加入新的离心管中，再加入900 µL异丙醇，混匀后放入‑20℃作用5 min后13000 rpm离心10 min；弃上清，加入1 mL 75% DEPC水处理的乙醇，轻轻混匀，放入‑20℃作用5 min后13000 rpm离心10 min，弃上清；根据HiScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒说明书进行病毒cDNA的反转录；反转录好的cDNA，于‑20℃保存备用；(3‑3)目的片段的扩增及纯化(3‑3‑1)使用Phanta Max Super‑Fidelity DNA Polymerase，以病毒cDNA 为模板，扩增HA及NA基因片段，25µL PCR体系如下：10×PCR buffer/12.5 μL、dNTP(10 Mm)/0.5 μL、上游引物(25 µmol/µL)/0.5 μL、下游引物(25 µmol/µL)/0.5 μL、高保真酶/0.5 μL、DNA模板/2 μL、ddH2O/8.5 μL；(3‑3‑2)反应程序：预变性温度为95℃3min；然后以95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸1.5 min，进行35个循环，最后72℃延伸10min；(3‑3‑3)将PCR产物通过1%琼脂糖凝胶水平电泳进行鉴定，以核酸MarkerGeneRuler 1 kb DNA Ladder为标准参照，染色后观察结果，成功扩增出了SN株HA基因片段，命名为SN‑HA，以及三株病毒的NA基因片段，分别命名为NA1、NA2和NA3；(3‑3‑4)将PCR产物条带切下后，按照使用用凝胶纯化回收试剂盒说明进行目的片段的纯化，测定纯化产物的浓度和纯度；(3‑4)目的片段与T载体的连接参照pEASY‑Blunt3 Cloning Kit和Trans1‑T1感受态细胞使用说明，将其克隆至T载体，连接产物转化Trans1‑T1感受态细胞，挑斑小提质粒，经EcoR I酶切鉴定阳性的质粒送金斯瑞生物工程有限公司测序验证，测序正确的质粒‑20℃保存备用；(3‑5)HA、NA片段及真核表达载体的酶切与连接将鉴定为阳性克隆的HA及NA质粒测定浓度后，分别用BsmBⅠ、Bsa I限制性内切酶进行酶切，将pHW2000载体用BsmBⅠ 酶切，酶切后产物进行琼脂糖凝胶电泳，把相应大小条带的胶块切下并胶回收，用T4连接酶将酶切后的pHW2000载体和目的产物连接，连接产物转化感受态细胞Trans1‑T，于37℃培养箱培养12‑14 h，挑取单个菌落于15 mL氨苄LB液体培养基中培养过夜，菌落PCR鉴定，将大小正确的菌液进行测序，测序结果正确后，用QIAGEN试剂盒提取质粒，测定其浓度和纯度，选取浓度在300 ng/μL以上，OD260/OD280在1.8‑2.0之间的质粒保存备用；(4)病毒拯救(4‑1)将构建好的HA片段表达质粒pHW‑SN‑HA分别与构建好的不同解凝速度病毒的NA片段表达质粒pHW‑NA1、pHW‑NA2以及pHW‑NA3组合，以PR8其余6个片段为骨架进行转染，同时转染pHW‑SN‑HA与PR8其他7个片段组合的重组病毒作为对照；(4‑2)用含10%胎牛血清的DMEM细胞培养基提前复苏并扩大培养293T细胞和MDCK细胞，在转染前一天，将293T细胞及MDCK细胞以3:1的比例混匀铺于35 mm的细胞培养皿，培养至细胞汇合度70%‑80%时，可以进行转染，转染之前1 h将细胞培养液换成1 mL的无抗无血DMEM培养...

【技术特征摘要】
1.H9N2亚型禽流感病毒疫苗候选株rHANA3的构建方法，其特征在于，所述构建方法如下：(1)解凝试验筛选不同解凝速度的H9N2亚型毒株分离鉴定保存H9N2AIV：W2-17、SN、QD5、FY2014040、WJ100和YZ4作为候选株，将候选H9N2亚型禽流感病毒经2倍梯度稀释后，再加等量的1%鸡红细胞，4℃作用30min后转移至37℃中，每隔一小时记录每个病毒株的HA效价，绘制解凝曲线，分析病毒解凝速度，筛选毒株；(2)血凝试验筛选HA片段对候选毒株进行血凝试验，测定各候选H9N2亚型AIV的HA效价，选取其中血凝效价最高的病毒，构建其HA基因表达质粒；(3)HA及NA片段表达质粒的构建方法如下：(3-1)引物设计参照Hoffmann对流感病毒的8个片段设计的通用引物，设计HA及NA片段全长扩增引物；(3-2)病毒RNA的提取及cDNA反转录根据TrizolReagent试剂说明提取病毒RNA；将病毒尿囊液8000rpm离心10min取250µL加入RNase-free的离心管中；加入500µLTrizolReagent，充分混匀后，放置5min；加入200µL三氯甲烷，剧烈混匀后，13000rpm离心10min；将上步中离心上清液450µL加入新的离心管中，再加入900µL异丙醇，混匀后放入-20℃作用5min后13000rpm离心10min；弃上清，加入1mL75%DEPC水处理的乙醇，轻轻混匀，放入-20℃作用5min后13000rpm离心10min，弃上清；根据HiScript1stStrandcDNASynthesisKit反转录试剂盒说明书进行病毒cDNA的反转录；反转录好的cDNA，于-20℃保存备用；(3-3)目的片段的扩增及纯化(3-3-1)使用PhantaMaxSuper-FidelityDNAPolymerase，以病毒cDNA为模板，扩增HA及NA基因片段，25µLPCR体系如下：10×PCRbuffer/12.5μL、dNTP(10Mm)/0.5μL、上游引物(25µmol/µL)/0.5μL、下游引物(25µmol/µL)/0.5μL、高保真酶/0.5μL、DNA模板/2μL、ddH2O/8.5μL；(3-3-2)反应程序：预变性温度为95℃3min；然后以95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸1.5min，进行35个循环，最后72℃延伸10min；(3-3-3)将PCR产物通过1%琼脂糖凝胶水平电泳进行鉴定，以核酸MarkerGeneRuler1kbDNALadder为标准参照，染色后观察结果，成功扩增出了SN株HA基因片段，命名为SN-HA，以及三株病毒的NA基因片段，分别命名为NA1、NA2和NA3；(3-3-4)将PCR产物条带切下后，按照使用用凝胶纯化回收试剂盒说明进行目的片段的纯化，测定纯化产物的浓度和纯度；(3-4)目的片段与T载体的连接参照pEASY-Blunt3CloningKit和Trans1-T1感受态细胞使用说明，将其克隆至T载体，连接产物转化Trans1-T1感受态细胞，挑斑小提质粒，经EcoRI酶切鉴定阳性的质粒送金斯瑞生物工程有限公司测序验证，测序正确的质粒-20℃保存备用；(3-5)HA、NA片段及真核表达载体的酶切与连接将鉴定为阳性克隆的HA及NA质粒测定浓度后，分别用BsmBⅠ、BsaI限制性内切酶进行酶切，将pHW2000载体用BsmBⅠ酶切，酶切后产物进行琼脂糖凝胶电泳，把相应大小条带的胶块切下并胶回收，用T4连接酶将酶切后的pHW2000载体和目的产物连接，连接产物转化感受态细胞Trans1-T，于37℃培养箱培养12-14h，挑取单个菌落于15mL氨苄LB液体培养基中培养过夜，菌落PCR鉴定，将大小正确的菌液进行测序，测序结果正确后，用QIAGEN试剂盒提取质粒，测定其浓度和纯度，选取浓度在300ng/μL以上，OD260/OD280在1.8-2.0之间的质粒保存备用；(4)病毒拯救(4-1)将构建好的HA片段表达质粒pHW-SN-HA分别与构建好的不同解凝速度病毒的NA片段表达质粒pHW-NA1、pHW-NA2以及pHW-NA3组合，以PR8其余6个片段为骨架进行转染，同时转染pHW-SN-HA与PR8其他7个片...

【专利技术属性】
技术研发人员：王泽源，李卓恬，苏湘，彭大新，陈素娟，秦涛，乔依漪，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32