一种高抗柳蓝叶甲质体转Bt基因杨树新品种的获得方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，公开了一种高抗柳蓝叶甲质体转Bt基因杨树新品种的获得方法，人工改造的Bt‑cry3Bb基因克隆到山新杨质体转化载体pYY20上，经过酶切验证、PCR验证和测序验证后，获得了Bt‑cry3Bb基因山新杨质体转化载体pYY26；再用金粉包裹pYY26质粒DNA通过基因枪转化法导入山新杨叶绿体基因组中，经Southern blot检验得到的阳性抗性芽，在经过叶片抗性再生后，获得同质化的质体转Bt‑cry3Bb基因山新杨植株。本发明专利技术得到的转Bt基因山新杨对柳蓝叶甲幼虫和成虫都是高致死的，由此获得了一种高抗柳蓝叶甲质体转Bt‑cry3Bb基因杨树新品种。

A New Poplar Variety with High Resistance to Salix Blue Leaf Methoplast Transgenic Bt Gene

The invention belongs to the field of biotechnology, and discloses a method for obtaining a new variety of Poplar with high resistance to Bt gene transformation from Salix Blue Leaf beetles. The artificially modified Bt_cry3Bb gene is cloned onto the plasmid transformation vector pYY20 of Populus davidiana, and after being verified by digestion, PCR and sequencing, the plasmid transformation vector pY26 of Populus davidiana with Bt cry3Bb gene is obtained, and then the pY26 plasmid DNA is wrapped in gold powder and passed through. The positive resistant buds obtained by Southern blot test were introduced into the chloroplast genome of Populus davidiana by gene gun transformation. After leaf resistance regeneration, the homogenized plastid-transformed plants of Populus davidiana Bt cry3Bb were obtained. The Bt transgenic Poplar obtained by the present invention is highly lethal to larvae and adults of the Salix Blue Leaf beetle, thereby obtaining a New Poplar Variety with high resistance to the Salix blue leaf beetle Bt cry3Bb gene.

【技术实现步骤摘要】
一种高抗柳蓝叶甲质体转Bt基因杨树新品种的获得方法
本专利技术属于生物
，尤其涉及一种高抗柳蓝叶甲质体转Bt基因杨树新品种的获得方法。
技术介绍
目前，业内常用的现有技术是这样的：杨树(PopulusL.)是杨属的植物，全属有约100多种，是世界上分布最广、适应性最强的树种。我国约62种(包括6杂交种)，其中分布中国的有57种，引入栽培的约4种，此外还有很多变种、变型和引种的品系。在中国分布范围跨北纬25°～53°，东经76°～134°，遍及东北、西北、华北和西南等地。杨树是一种重要的经济林木和模式木本植物。杨树因速生丰产、实用性强、分布广、无性繁殖能力强，且基因组较小而成为研究林木生理和利用基因工程方法进行遗传改良的理想模式植物。杨树也是一种重要的可再生资源，杨木的用途很广。另外，杨树对环境保护也很重要，包括土地重新造林和污染土壤植物修复。我国是世界上木材及木制品的生产大国，同时也是一个消费大国。人均占有森林资源很少的国家，1998年实施了天然林保护工程，使得我国木材供需矛盾更加突出。所以，种植杨树，不仅有巨大的经济效益，而且有很大的生态效益和社会效益。现我国已成为世界上杨树人工林面积最大的国家。对于我国来说，大力发展转基因杨树具有重大的意义，但由于杨树具有生长周期长、树体高大等特点以及杨树人工林容易发生大规模的虫害，而导致杨树发生虫害的害虫大多数是食叶类的害虫。危害杨树的鞘翅目害虫合计7科34种，以天牛科种类最为丰富，其中光肩星天牛、桑天牛、桃红颈天牛危害最为严重，金龟子、象甲科危害次之，而柳蓝叶甲对杨树叶片的危害也较严重，尤其对1年龄之内的杨树危害更大，极大地限制了杨树传统育种和栽培工作的开展。利用基因工程技术培育抗虫杨树品种已成为研究的热点之一。为了解决我国林木短缺，加快人工林的发展，急需进行优良抗虫杨树品种的开发和利用，在2001年批准了2种转Bt杨树可以进行商业化种植，分别是转Bt-cry1A基因的黑杨(Populusnigra)和转Bt-cry1Ac基因和API(慈姑蛋白酶抑制剂)基因的741杨[P.alba(P.davidiana×P.simonii)×P.tomentosa]，使我国成为唯一批准转基因杨树商业化种植的国家，目前，已有近22个抗虫杨树品种获准进行小规模田间试验、环境释放或中试生产，出于对转基因商业化的慎重，我国没有再批准新的商业杨树品种山新杨是一种优良的杨树品种，它以采自嫩江县高峰林场山杨为母本，父本新疆杨来源于乌鲁木齐，于1964年进行杂交组合，经20年栽培试验，表现良好，性状稳定。适应性强，抗逆性好，常用于防风固沙。树干通直，树皮光滑淡绿色，披白粉，20年生树皮尚未开裂，果序自然脱落且不飞絮。近年来，质体基因转化技术成为植物基因工程研究的热点之一，质体基因转化有诸多的优点，如：母系遗传、高效表达、无基因沉默、无位置效应、无基因污染等优点，而山新杨的繁殖是无性繁殖：不飞絮等特点，使其质体转基因更安全。用质体转基因技术转抗虫基因到杨树质体中，既能够达到相应的抗虫效果，又增加了生物安全性。综上所述，现有技术存在的问题是：现有技术中，杨树对柳蓝叶甲幼虫和成虫的高致死的效果防范差。在抗虫性能，核转Bt基因杨树比质体转Bt基因杨树差，导致杨树利用短缺。在基因的表达量方面，核转Bt基因杨树中Bt蛋白的表达量大多数较低，而且在杨树的各个组织中都有表达，在杨木中积累量较高。核转Bt基因整合位点存在不确定性，容易造成位置效应。在生物安全性方面，核转Bt基因杨树容易通过花粉使外源基因逃逸，农杆菌介导的转化容易造成带有Bt基因的农杆菌逃逸。解决上述技术问题的难度：目前所有的转Bt基因杨树均为核转基因，核转基因的缺点，如基因整合位点的不确定性、表达量不稳定和基因逃逸等，这些缺点目前较难克服。解决上述技术问题的意义：与核转基因相比，质体转基因较好的解决了这些问题，如定点整合到叶绿体基因组中；表达产物固定在叶绿体中；母系遗传方式，不会通过花粉传播外源基因；基因表达量大都较高。本专利技术的这些优点使得质体转基因生物安全性更高。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种高抗柳蓝叶甲质体转Bt基因杨树新品种的获得方法。本专利技术是这样实现的，一种高抗柳蓝叶甲质体转Bt基因杨树新品种的获得方法包括：人工改造的Bt-cry3Bb基因克隆到山新杨质体转化载体pYY20上，经过酶切验证、PCR验证和测序验证后，获得了Bt-cry3Bb基因山新杨质体转化载体pYY26；pYY26的氨基酸序列为SEQIDNO：1；再用金粉包裹pYY26质粒DNA通过基因枪转化法导入山新杨叶绿体基因组中，经壮观霉素筛选后获得多个抗性芽，经Southernblot检验得到的阳性抗性芽，在经过叶片抗性再生后，获得同质化的质体转Bt-cry3Bb基因山新杨植株。进一步，转Bt-cry3Bb基因山新杨质体转化载体的构建方法包括：以p3300-cry3Bb质粒DNA为模板，用cry3Bb-F5’GCGGCCGCTCAGAGCTGGACAGGGATGAACTC和cry3Bb-R5’CCATGGCCAACCCTAACAACAGGTC3’这对引物，再用Pfu酶通过PCR扩增cry3Bb基因序列，PCR产物经PCR洁净试剂盒纯化后，与平末端载体-BluntSimple连接后转化大肠杆菌XL10-gold，把得到的重组子经PCR验证和酶切验证后，再进行测序验证后，得到重组子pYY24；用限制性内切酶NcoI和NotI双酶切pYY24质粒DNA，经琼脂糖凝胶电泳后，切取对应的凝胶上的小片段胶块，用凝胶回收试剂盒回收，把得到的小片段与用限制性内切酶NcoI和NotI双酶切山新杨转化载体pYY20后得到的大片段连接，并转化大肠杆菌XL10-gold，把得到的重组子经PCR验证和酶切验证后，进行测序验证正确的重组子命名为pYY26，即为Bt-cry3Bb基因山新杨质体转化载体。进一步，用基因枪法把pYY26质粒DNA导入山新杨基因组和抗性芽的筛选方法包括：用0.6μm的金粉包裹pYY26质粒DNA，利用Bio-Rad基因枪轰击杨树叶片，基因枪参数：氦气压为1100psi，轰击距离9cm真空度28；筛选培养条件为：25℃16h光照/20℃8h黑暗，光照强度：20-25μE·m-2·s-1。进一步，转Bt-cry3Bb基因山新杨植株的获得和分子鉴定方法包括：转Bt-cry3Bb基因山新杨抗性芽的初步鉴定：取在30mg/L壮观霉素PaSIM2上生长的抗性芽的叶片和常规培养的野生型山新杨叶片，以提取其叶片总DNA为模板，用JC-Pa-F5’GGGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAACTGCAGTATTTG3’和JC-Pa-R5’CGGTACTTGTGATATTTCGGCTTG3’这对引物，进行PCR检测；转cry3Bb基因山新杨抗性芽的Southernblot分析：提取经PCR初步验证转cry3Bb基因山新杨植株叶片和野生型山新杨植株叶片总DNA，用限制性内切酶NdeI将5μg山新杨野生型叶片总DNA和转基因山新杨叶片总DNA样品分别酶切后，经琼脂糖凝胶电泳后，通过半干转移法把RNA转移到尼龙膜上；以杨树基因组DNA为模板，用psaB-p本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高抗柳蓝叶甲质体转Bt基因杨树新品种的获得方法，其特征在于，所述高抗柳蓝叶甲质体转Bt基因杨树新品种的获得方法包括：人工改造的Bt‑cry3Bb基因克隆到山新杨质体转化载体pYY20上，经过酶切验证、PCR验证和测序验证后，获得了Bt‑cry3Bb基因山新杨质体转化载体pYY26；pYY26的氨基酸序列为SEQ ID NO：1；再用金粉包裹pYY26质粒DNA通过基因枪转化法导入山新杨叶绿体基因组中，经壮观霉素筛选后获得多个抗性芽，经Southern blot检验得到的阳性抗性芽，在经过叶片抗性再生后，获得同质化的质体转Bt‑cry3Bb基因山新杨植株。

【技术特征摘要】
1.一种高抗柳蓝叶甲质体转Bt基因杨树新品种的获得方法，其特征在于，所述高抗柳蓝叶甲质体转Bt基因杨树新品种的获得方法包括：人工改造的Bt-cry3Bb基因克隆到山新杨质体转化载体pYY20上，经过酶切验证、PCR验证和测序验证后，获得了Bt-cry3Bb基因山新杨质体转化载体pYY26；pYY26的氨基酸序列为SEQIDNO：1；再用金粉包裹pYY26质粒DNA通过基因枪转化法导入山新杨叶绿体基因组中，经壮观霉素筛选后获得多个抗性芽，经Southernblot检验得到的阳性抗性芽，在经过叶片抗性再生后，获得同质化的质体转Bt-cry3Bb基因山新杨植株。2.如权利要求1所述的高抗柳蓝叶甲质体转Bt基因杨树新品种的获得方法，其特征在于，转Bt-cry3Bb基因山新杨质体转化载体的构建方法包括：以p3300-cry3BbDNA质粒为模板，用cry3Bb-F5’GCGGCCGCTCAGAGCTGGACAGGGATGAACTC和cry3Bb-R5’CCATGGCCAACCCTAACAACAGGTC3’这对引物，再用Pfu酶通过PCR扩增cry3Bb基因序列，PCR产物经PCR洁净试剂盒纯化后，与平末端载体-BluntSimple连接后转化大肠杆菌XL10-gold，把得到的重组子经PCR验证和酶切验证，再进行测序验证后，得到重组子pYY24；用限制性内切酶NcoI和NotI双酶切pYY24质粒DNA，经琼脂糖凝胶电泳后，切取对应的凝胶上的小片段胶块，用凝胶回收试剂盒回收，把得到的小片段与用限制性内切酶NcoI和NotI双酶切山新杨转化载体pYY20后得到的大片段连接，并转化大肠杆菌XL10-gold，把得到的重组子经PCR验证和酶切验证后，进行测序验证后获得正确的重组子，命名为pYY26，即为质体转Bt-cry3Bb基因山新杨质体转化载体。3.如权利要求1所述的高抗柳蓝叶甲质体转Bt基因杨树新品种的获得方法，其特征在于，用基因枪法把pYY26质粒DNA导入山新杨基因组和抗性芽的筛选方法包括：用0.6μm的金粉包裹pYY26质粒DNA，利用Bio-Rad基因枪轰击杨树叶片，基因枪参数：氦气压为1100psi，轰击距离9cm真空度28；筛选培养条件为：25℃16h光照/20℃8h黑暗，光照强度：20-25μE·m-2·s-1。4.如权利要求1所述的高抗柳蓝叶甲质体转Bt基因杨树新品种的获得方法，其特征在于，转Bt-cry3Bb基因山新杨植株的获得和分子鉴定方法包括：转Bt-cry3Bb基因山新杨抗性芽的初步鉴定：取在30mg/L壮观霉素PaSIM...

【专利技术属性】
技术研发人员：张江，张意秋，武玉永，李圣纯，徐乐天，常玲，
申请(专利权)人：湖北大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42