一株富硒短小芽孢杆菌菌株D1-019及其分离筛选方法和应用技术

一株富硒短小芽孢杆菌菌株D1‑019及其分离筛选方法和应用，该菌株于2018年07月09日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏序号为：CCTCC M No:2018459。所述富硒短小芽孢杆菌菌株Bacillus pumilus D1‑019采用光密度法和红硒法进行筛选，对种鸭饲料来源益生菌进行逐级耐无机硒筛选，筛选出耐硒能力强的菌株，通过形态观察和16S rDNA分子生物学鉴定方法，鉴定出D1‑019菌为短小芽孢杆菌。所述菌株有机硒转化率达100％，并在一定时间内增加饲料与食品中的有机硒含量。作为一种新型有机硒源，能够应用于饲料、饲料发酵剂、食品和保健品领域。

A Selenium-rich Bacillus brevis strain D1-019 and its isolation, screening and Application

A Selenium-enriched Bacillus brevis strain D1 019 and its isolation and screening method and application were preserved in the China Typical Culture Preservation Center on July 09, 2018 with the conservative serial number CCTCC M No: 2018459. Bacillus pumilus D1_019, a selenium-rich Bacillus brevis strain, was screened by optical density method and red selenium method. The probiotics from duck feed source were screened step by step for inorganic selenium tolerance, and the strains with strong selenium tolerance were screened. Through morphological observation and 16S rDNA molecular biology identification method, the strain D1_019 was identified as Bacillus brevis. The organic selenium conversion rate of the strain reaches 100%, and the organic selenium content in feed and food is increased within a certain period of time. As a new organic selenium source, it can be used in feed, feed starter, food and health products.

【技术实现步骤摘要】
一株富硒短小芽孢杆菌菌株D1-019及其分离筛选方法和应用
本专利技术涉及食品生物
，具体是一株富硒短小芽孢杆菌菌株BacilluspumilusD1-019及其分离筛选方法和应用。
技术介绍
硒是生物体必需的一种重要微量元素，与机体正常生理功能的维持以及多种疾病的发生发展密切相关。一旦缺硒，就会引发许多症状，同时会影响基因的表达和正常生理代谢的紊乱；缺硒会使幼畜出现白肌病。归纳起来，硒的生物学功能有抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、保肝解毒、提高机体免疫力、调节机体代谢、影响繁殖功能等。现如今，部分地区的补硒主要手段仍是利用无机硒化合物制成补充剂，但是其毒副作用和利用率的弊端越来越被放大，需要改变补硒方式。有机硒补硒被认为是最安全也是最有效的手段。自上世纪八九十年代起，国内外对生物补硒的关注和研究持续至今，对硒的转化机理的了解越来越深入。益生菌作为一种无毒、无抗药性、无副作用、无残留且无污染的饲料添加剂而受人们重视。目前，《饲料添加剂品种目录》2013版中允许添加的微生物菌种共35种。其中，芽孢杆菌是最理想的微生物添加剂之一，它具有较高的蛋白酶、纤维素酶和淀粉酶活性，对植物性碳水化合物有较强的降解能力，且物理性质十分稳定，因而在饲料中的应用研究也非常多。大量研究表明，在日粮中添加适量的富硒益生菌可以提高幼畜的生产性能，显著提高免疫功能、抗氧化水平和基因表达水平。富硒益生菌也可以拮抗致病菌在动物肠道定植；可以抗诱变及抗癌；调节肠道菌群。富硒微生物中，研究最为成熟的是富硒酵母和富硒乳酸菌，现已进入工业化生产阶段，但是对芽孢杆菌的富硒条件研究极少。目前，饲用富硒益生菌的研究呈现出以下问题：高富硒转化率的益生菌种类开发少；富硒益生菌菌株在饲料中的活力和适应性需经过研究和安全性评价才可添加进入饲料等。因此，有必要开发新型高效合成有机硒的益生菌，特别是适用于生物饲料领域的富硒芽孢杆菌。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一株富硒短小芽孢杆菌菌株BacilluspumilusD1-019及其分离筛选方法和应用。本专利技术的技术方案是：一种富硒短小芽孢杆菌菌株BacilluspumilusD1-019，该菌株于2018年07月09日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏序号为：CCTCCMNo:2018459。所述富硒短小芽孢杆菌菌株BacilluspumilusD1-019的16srDNA序列如序列表SEQIDNo.1所示。所述富硒短小芽孢杆菌菌株BacilluspumilusD1-019的富硒培养方法，培养基中亚硒酸钠浓度为0-1730μg/mL、5-500μg/mL、5-20μg/mL、20μg/mL或为15μg/mL。所述富硒短小芽孢杆菌菌株BacilluspumilusD1-019的分离和筛选方法，根据菌体颜色和红硒现象，对种鸭饲料来源菌株的耐硒能力进行初筛、复筛、鉴定，分离出高有机硒转化率的菌株，具体步骤为：所述初筛是将菌种库中菌种在一级培养基中活化，一级培养基为大豆胨5g/L，蛋白胨2.5g/L，酪蛋白胨2.5g/L，酵母浸粉2.5g/L，牛肉粉5g/L，抗坏血酸钠0.5g/L，β-甘油磷酸钠19g/L，硫酸镁0.25g/L，0.5％乳糖，pH7.0-7.4，30℃培养36h，测定OD600值后，以1:39体积比例加入二级培养液中，二级培养基是在一级培养基的基础上加入0,25,50μg/mL梯度浓度的亚硒酸钠，30℃静置培养36h，根据菌液颜色变化及红硒现象，筛选出耐硒菌株，所述复筛是将初筛菌株在浓度范围为50-1730μg/mL的Na2SeO3条件下，根据菌液颜色变化及红硒现象重复上述筛选步骤，选出耐硒菌株，所述鉴定是将耐硒的菌株进行形态观察、革兰氏染色、16srDNA序列分析，并构建系统发育树鉴定菌株，所述有机硒转化能力是将样品进行湿法消化处理后，采用ICP-MS方法检测其中质量数为78的Se元素含量，计算出无机硒含量，然后根据菌株培养前后培养液中无机硒利用率表示菌株对有机硒的转化能力，富硒转化率计算公式为：所述富硒短小芽孢杆菌菌株BacilluspumilusD1-019作为有机硒源的应用。所述富硒短小芽孢杆菌菌株BacilluspumilusD1-019在生物饲料中应用，其特征在于，饲料中含有富有机硒的短小芽孢杆菌菌剂，所述菌剂中芽孢杆菌的含量为1.0×106～1.0×1012CFU/mL、1.0×108～1.0×1011CFU/mL或是1.0×109～1.0×1010CFU/mL。所述富硒短小芽孢杆菌菌株BacilluspumilusD1-019在食品中应用，其特征在于，食品中含有富有机硒的短小芽孢杆菌菌剂和/或富有机硒短小芽孢杆菌有机硒组分的提取物，所述菌剂含有所述芽孢杆菌含量为1.0×106～1.0×1012CFU/mL、1.0×108～1.0×1011CFU/mL或是1.0×109～1.0×1010CFU/mL。所述富硒短小芽孢杆菌菌株BacilluspumilusD1-019作为生物饲料发酵剂的应用，含有所述富硒短小芽孢杆菌菌剂和无机硒，在所述菌剂中芽孢杆菌的含量为1.0×106～1.0×1012CFU/g、1.0×108～1.0×1011CFU/g或是1.0×109～1.0×1010CFU/g，所述无机硒为亚硒酸钠终浓度为0.001～500μg/mL、5～20μg/mL或是15μg/mL。本专利技术的突出优点在于：1、所述富硒短小芽孢杆菌菌株BacilluspumilusD1-019筛选自种鸭饲料的益生菌，有利于回归应用于饲料领域。2、所述富硒短小芽孢杆菌菌株BacilluspumilusD1-019有机硒转化率达到100％，为具有迄今为止报道的最高值，作为高有机硒源的益生菌，在发挥益生菌功效的同时，可用做有效补充有机硒的食品、饲料添加剂，并可用作新型生物饲料发酵剂。3、所述富硒短小芽孢杆菌菌株BacilluspumilusD1-019筛选方法，为首次结合耐受无机硒能力和红硒现象，对种鸭饲料来源菌株进行初筛、复筛、鉴定，分离出高有机硒转化率的菌株，具有推广应用于其他来源饲用富有机硒益生菌的价值。附图说明图1为富硒短小芽孢杆菌菌株BacilluspumilusD1-019的筛选。(A)光密度法初筛结果二维散点图；(B)光密度法初筛结果三维散点图；(C)光密度法复筛结果柱状图；(D)红硒法复筛结果柱状图。图2为富硒短小芽孢杆菌菌株BacilluspumilusD1-019的菌落形态图(A)和革兰氏染色结果图(B)。图3为富硒短小芽孢杆菌菌株BacilluspumilusD1-019总DNA提取结果(A)和PCR扩增结果琼脂凝胶电泳图(B)。图4为富硒短小芽孢杆菌菌株BacilluspumilusD1-019系统发育树。图5为富硒短小芽孢杆菌菌株BacilluspumilusD1-019生长曲线。图6为硒含量测定标准曲线。具体实施方式下面通过实施例对本专利技术的技术方案作进一步说明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1富硒芽孢杆菌的分离筛选方法根据菌体颜色和红硒现象，对种鸭饲料来源菌株的耐硒能力进行初筛、复筛分本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株富硒短小芽孢杆菌菌株D1‑019，其特征在于：该菌株于2018年07月09日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏序号为：CCTCC M No：2018459。

【技术特征摘要】
1.一株富硒短小芽孢杆菌菌株D1-019，其特征在于：该菌株于2018年07月09日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏序号为：CCTCCMNo：2018459。2.权利要求1所述富硒短小芽孢杆菌菌株D1-019的16SrDNA基因，其特征在于：其核苷酸序列如序列表SEQIDNo.1所示。3.权利要求1所述富硒短小芽孢杆菌菌株D1-019的富硒培养方法，其特征在于，培养基中亚硒酸钠浓度为0-1730μg/mL、5-500μg/mL、5-20μg/mL、20μg/mL或为15μg/mL。4.权利要求1所述富硒短小芽孢杆菌菌株D1-019的分离和筛选方法，其特征在于，根据菌体颜色和红硒现象，对种鸭饲料来源菌株的耐硒能力进行初筛、复筛、鉴定，分离出高有机硒转化率的菌株，具体步骤为：所述初筛是将菌种库中菌种在一级培养基中活化，一级培养基为大豆胨5g/L，蛋白胨2.5g/L，酪蛋白胨2.5g/L，酵母浸粉2.5g/L，牛肉粉5g/L，抗坏血酸钠0.5g/L，β-甘油磷酸钠19g/L，硫酸镁0.25g/L，0.5％乳糖，pH7.0-7.4，30℃培养36h，测定OD600值后，以1:39体积比例加入二级培养液中，二级培养基是在一级培养基的基础上加入0,25,50μg/mL梯度浓度的亚硒酸钠，30℃静置培养36h，根据菌液颜色变化及红硒现象，筛选出耐硒菌株，所述复筛是将初筛菌株在浓度范围为50-1730μg/mL的Na2SeO3条件下，根据菌液颜色变化及红硒现象重复上述筛选步骤，选出耐硒菌株，所述鉴定是将耐硒的菌株进行形态观察、革兰氏染色...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘小玲，孙毓，肖益新，王成华，张冉，余炼，白云霞，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：广西,45