本发明专利技术公开了一种双通道识别活细胞与死细胞的荧光探针RPIC，其化学结构式如式（I）所示；同时本发明专利技术还提供了该荧光探针的制备方法以及其应用；最后公开了所述荧光探针在在固定细胞与加H2O2的细胞的生物学上的应用。本发明专利技术的荧光探针通过双激发双发射通道的不同来识别活细胞与死细胞，能够避免假阳性结果和误导信号，预示该探针能够在生理学与病理学的研究进展中作为一个重要工具。
Dual Channel Fluorescent Probe for Recognition of Living and Dead Cells and Its Preparation Method
The invention discloses a dual-channel fluorescent probe RPIC for identifying living and dead cells, the chemical structure of which is shown in formula (I); at the same time, the invention also provides the preparation method of the fluorescent probe and its application; finally, the application of the fluorescent probe in the biology of fixed cells and cells added with hydrogen peroxide is disclosed. The fluorescent probe of the invention identifies living and dead cells by the difference of double excitation double emission channels, avoids false positive results and misleading signals, and indicates that the fluorescent probe can be used as an important tool in the research progress of physiology and pathology.
【技术实现步骤摘要】
双通道识别活细胞与死细胞的荧光探针及其制备方法
本专利技术涉及一种双通道识别活细胞与死细胞的荧光探针及其制备方法，尤其涉及一种在双激发双发射通道的罗丹明类化合物荧光探针及其制备方法与应用；属于有机小分子荧光探针领域。
技术介绍
细胞凋亡是胚胎发育过程中发生的一种正常的生理过程，参与组织稳态的维持。细胞凋亡缺陷是导致自身免疫性疾病、神经退行性疾病和癌症等多种病理过程的主要原因。选择性诱导细胞凋亡是一种有效的肿瘤治疗策略。凋亡的检测和监测不仅在许多细胞生物学和临床研究中具有重要意义，而且在凋亡靶向治疗的治疗评估中也具有重要意义。因此，在医学和病理学研究中，有必要使用一种有效的方法来可视化细胞凋亡和区分活细胞和死细胞。目前，用于鉴别活细胞与死细胞的试剂大致可以分为两类。第一种是比色试剂：MTT是一种常用的细胞毒性试剂扩散的测试；第二种是荧光探针：与比色剂相比，荧光剂的荧光性能较好，探针具有较高的灵敏度和灵敏度，具有细胞和组织的原位成像能力是一种较好的检测工具。尽管有许多能够鉴别活细胞与死细胞的探针被合成研究出来，但大多数的探针都为单光子的探针。但是这些探针会检测到一定的误导信号，同时不可避免的出现染色不均一的现象。
技术实现思路
为了避免可能的误导结果和提供更准确的信息，本专利技术提供了一种在双激发双发射通道识别活细胞与死细胞的罗丹明类化合物荧光探针，可以同时检测两个通道的荧光，减少了假阳性信号和不均匀染色的影响。本专利技术要解决的问题是提供一种及其生物学性质。一种双通道识别活细胞与死细胞的荧光探针，命名为RPIC，其化学结构式如式（I）所示：所述荧光探针是以绿色与深红色双通道的变化来识别活细胞与死细胞。上述识别活细胞与死细胞的荧光探针的制备方法，包括以下步骤：（1）将环己酮与4-二乙氨基酮酸以浓硫酸做溶剂，加热回流，用高氯酸析出沉淀，过滤得到化合物1；（2）将化合物1与对苯二甲醛以冰醋酸做溶剂，加热回流，反应结束后，将产物通过柱层析法进行分离提纯，得化合物2；（3）将化合物2与菲醌以冰醋酸做溶剂，加热回流，反应结束后，将产物通过柱层析法进行分离提纯，得化合物RPIC。上述识别活细胞与死细胞的荧光探针在识别活细胞与死细胞上的应用。相关实验证实：在癌细胞与吞噬细胞中，本专利技术所述的荧光探针RPIC可以通过区分深红色和绿色两种颜色的通道来区分活细胞和死细胞。在紫外吸收光谱中发现有多个吸收波长处，证明该探针能够用双激发（图3）。取390nm为激发波长，得到荧光发射光谱（图4）。在细胞的固定实验中试验中，可以看见活细胞在深红通道有强的荧光，固定的死细胞在绿色通道有强的荧光，而在深红通道没有光（图5）；在加入过氧化氢的过程中，没有加入过氧化氢的正常细胞，在深红通道有强的荧光，在绿色通道没有光。加入过氧化氢后，状态变的不健康细胞，在绿色通道有强的荧光，而在深红通道没有光（图6）。推断，该探针能够以绿色与深红色双通道的变化来识别活死细胞。本专利技术有益效果1、双激发双发射通道识别本专利技术提供的荧光探针能够以绿色与深红色双通道的变化来识别活死细胞。2、避免假阳性结果和误导信号本专利技术提供的双激发双发射通道识别活细胞与死细胞的罗丹明类化合物荧光探针与其功能相近的传统单色光的荧光探针相比具有显著优势，能够避免假阳性结果和误导信号，且本专利技术所述罗丹明类化合物具有新颖性和简便性。3、可用于生理学与病理学的研究本专利技术提供的荧光探针及其研究为生物学成像应用奠定了理论基础，预示该探针能够在生理学与病理学的研究进展中作为一个重要工具。附图说明图1：化合物RPIC的核磁共振氢谱。图2：RPIC的核磁共振碳谱谱。图3：探针本身在不同溶剂中的紫外吸收光谱。图4：探针本身在不同溶剂中的荧光发射光谱。激发波长390nm。图5：正常细胞与固定细胞的荧光成像。图6：细胞加入过氧化氢后的生物学成像。探针的浓度:10uM；H2O2浓度：3Mm。具体实施方式实施例1一种双通道识别活细胞与死细胞的荧光探针的制备方法，包括以下步骤：1:在冰浴条件下，将0.628g(6.4mmol)的环己酮加入到浓硫酸(7ml)中，分批缓慢加入1g(3.2mmol)4-二乙氨基酮酸，加热，90℃条件下搅拌反应2h，反应结束后放至室温，将反应液加到约50g的冰中，缓慢滴加7ml的高氯酸，析出沉淀，抽滤，干燥，得橙色固体——化合物1。产率：90%。2:将0.2g(0.53mmol)化合物1、0.22g(1.6mmol)对苯二甲醛，溶于约15ml冰醋酸中，110℃条件下，加热回流反应6h，反应结束得到粗品，将粗品通过柱层析法，用CH2Cl2/CH3OH=60:1的展开剂进行分离提纯得到化合物2。产率：50%。3:将0.1g(0.2mmol)化合物2、0.042g(0.2mmol)菲醌、0.154g(2mmol)醋酸铵，溶于约20ml的冰醋酸中，氮气保护，110℃条件下，加热回流反应10h，反应结束后，减压除溶剂得粗品，将粗品通过柱层析法，用CH2Cl2/CH3OH=20:1的展开剂进行分离提纯得到化合物RPIC。产率：45%.1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm):13.51(s,1H),8.91(q,J=8.0Hz,2H),8.62(t,J=8.0Hz,2H),8.38(d,J=8.0Hz,2H),7.97(d,J=8Hz,1H),7.63-7.84(m,8H),7.49(s,1H),7.37(d,J=8Hz,1H),6.58(s,1H),6.40-6.48(m,2H),2.75-2.92(m,2H),1.91(s,1H),1.59-1.66(m,4H),1.23(s,3H),1.11(t,J=4.0Hz,6H)0.78-0.82(m,2H)13CNMR(100MHz,DMSO-d6)δ172.29,166.73,159.65,159.28,158.89,158.54,158.51,158.12,156.23,146.36,139.38,134.41,133.83,133.48,131.68,131.44,131.12,130.71,130.22,130.03,129.27,129.13,128.51,128.37,128.13,127.49,124.68,123.84,123.37,122.94,121.09,119.71,119.36,118.24,116.85,113.99,111.13,95.90,46.13,26.89,25.71,21.35,21.16,12.79.实施例2RPIC在不同溶剂中的紫外吸收光谱：预先准备1份10mL本专利技术探针的浓度为10-3M的N,N-二甲基甲酰胺溶液，然后分别取10μL加入两个相同的10mL容量瓶中，其中十个瓶中分别含有不同的溶剂，用相对应的不同溶液稀释到2mL，然后进行紫外吸收光谱的检测（λEx=430nm），结果见图3。结论：探针有多个吸收峰。实施例3RPIC在不同溶剂中的荧光发射光谱：预先准备1份10mL本专利技术的探针的浓度为10-3M的N,N-二甲基甲酰胺溶液，然后分别取10μL加入两个相同的10mL容量瓶中，其中十个瓶中分别含有不同的溶剂，用相对应的不同溶液稀释到2mL，然后进行荧光发射光谱的检测（λEx=390nm），结果见图本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种双通道识别活细胞与死细胞的荧光探针，命名为RPIC，其特征在于，其化学结构式如式（I）所示：
【技术特征摘要】
1.一种双通道识别活细胞与死细胞的荧光探针，命名为RPIC，其特征在于，其化学结构式如式（I）所示：。2.根据权利要求1所述的识别活细胞与死细胞的荧光探针，其特征在于，以绿色与深红色双通道的变化来识别活细胞与死细胞。3.一种权利要求1所述的的识别活细胞与死细胞的荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）将环己酮与4-二乙氨基酮酸以浓硫酸做溶...
【专利技术属性】
技术研发人员：林伟英，王伟珊，刘勇，牛杰，
申请(专利权)人：济南大学，
类型：发明
国别省市：山东,37
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