减轻球囊损伤后血管再狭窄的药物及大鼠模型构建方法技术

本发明专利技术属于医药技术领域，公开了一种减轻球囊损伤后血管再狭窄的药物及大鼠模型构建方法，减轻球囊损伤后血管再狭窄的药物为柚皮素；大鼠模型构建方法包括：采用2F球囊诱导雄性大鼠颈动脉球囊损伤模型，并在第1，3，7和14天观察新生内膜增生的病理过程；随后，每天通过灌胃法给予大鼠Nar(25，50，100mg/kg/d)，持续14天。本发明专利技术这些结果表明，Nar可通过抑制炎症因子的释放和氧化应激来抑制球囊损伤诱导的血管内膜增生，这可能与调控RIP1‑RIP3‑MLKL信号通路有关。

Drugs for alleviating restenosis after balloon injury and methods for establishing rat models

The invention belongs to the field of medical technology, and discloses a drug for alleviating restenosis after balloon injury and a method for constructing rat model. The drug for alleviating restenosis after balloon injury is naringenin. The method for constructing rat model includes: using 2F balloon to induce male rat carotid artery balloon injury model, and observing the pathological process of neointimal hyperplasia on the first, third, seventh and fourteenth days; Subsequently, rats were given Nar (25, 50, 100 mg/kg/d) by intragastric administration daily for 14 days. These results indicate that Nar can inhibit intimal hyperplasia induced by balloon injury by inhibiting the release of inflammatory factors and oxidative stress, which may be related to the regulation of RIP1 RIP3 MLKL signaling pathway.

【技术实现步骤摘要】
减轻球囊损伤后血管再狭窄的药物及大鼠模型构建方法
本专利技术属于医药
，尤其涉及一种减轻球囊损伤后血管再狭窄的药物及大鼠模型构建方法。
技术介绍
管再狭窄被证明是经皮冠状动脉介入治疗(PCI)的主要缺点，PCI是狭窄性冠状动脉血管病变的主要治疗方法，并且其特征在于新内膜增生，这是一种复杂的细胞和分子反应。近年来，已广泛接受内皮功能障碍和内膜区域中血管平滑肌细胞(VSMC)的异常增殖表型是血管再狭窄的触发点。虽然血管再狭窄的分子和细胞机制尚未完全阐明，但越来越多的证据表明PCI诱导的炎症反应和氧化应激在内膜增生的病理过程中起着重要作用。大量研究指出，炎症在许多血管疾病中起着至关重要的调节作用。据报道MAPK和NF-κB活化调节炎症过程参与TNF-α诱导的内皮细胞损伤；另外饮食诱导的血脂异常中的血管炎症可能受氧化应激和炎症细胞因子的调节。各种细胞因子和炎症介质有助于再狭窄的发病机制，例如促炎性细胞因子IL-1β和TNF-α，其在新内膜增生的发生发展过程中起着重要作用。鉴于这些发现，减少PCI诱导的炎症反应和氧化应激可能是减少新生内膜增生和血管再狭窄的有效途径。如今，大量证据表明受体相互作用蛋白激酶(RIPs)是程序性坏死性的一种关键调节机制之一，这是一种炎症形式的细胞死亡。已知RIP1和RIP3通过其RIP同型互作基序(RHIM)结构域介导的寡聚化在necrosomes中形成异二聚体丝状支架，但基于该支架的信号传导事件尚未完全解决。混合谱系激酶结构域样蛋白(MLKL)是功能性RIP3底物，其通过其激酶样结构域与RIP3结合但缺乏其自身的激酶活性。作为坏死性凋亡的典型机制，已报道RIP1-RIP3-MLKL信号传导途径与炎症密切相关，其可促进病理性炎症进程，而与其在细胞死亡中的功能无关。许多促炎细胞因子如TNF-α也能够引发坏死性凋亡。然而，尚未研究RIP1-RIP3-MLKL信号通路在球囊损伤后血管再狭窄的病理过程中的作用。柚皮素(Naringenin，Nar)是一种天然的二氢黄酮类化合物，具有多种药理学活性作用，包括抗菌，抗癌等作用。一些研究表明，Nar具有与炎症反应相关的血管损伤的治疗潜力，但尚未有关于Nar对血管再狭窄的潜在抑制作用的研究，尤其是对抗炎作用的关注。综上所述，现有技术存在的问题是：目前尚未研究调控RIP1-RIP3-MLKL信号通路在球囊损伤后血管再狭窄的病理过程中的作用。现有技术中，对柚皮素在治疗血管再狭窄上的作用，缺乏指导意义。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种减轻球囊损伤后血管再狭窄的药物及大鼠模型构建方法。基于以上所述，本专利技术假设柚皮素(Nar)可介导调控RIP1-RIP3-MLKL信号通路，该通路在调节炎症细胞因子以减轻球囊损伤后大鼠颈动脉再狭窄中起关键作用。因此，首先研究Nar对球囊损伤后颈总动脉内膜增生的影响。然后，研究了与抑制炎症细胞因子释放以及氧化应激相关的这种作用是否与调控RIP1-RIP3-MLKL信号通路有关。本专利技术是这样实现的，一种通过调控RIP1-RIP3-MLKL信号通路减轻球囊损伤后血管再狭窄的药物，所述通过调控RIP1-RIP3-MLKL信号通路减轻球囊损伤后血管再狭窄的药物为柚皮素。本专利技术的另一目的在于提供一种验证所述通过调控RIP1-RIP3-MLKL信号通路减轻球囊损伤后血管再狭窄的药物药效的大鼠模型的构建方法，所述大鼠模型的构建方法包括以下步骤：步骤一，采用2F球囊诱导雄性大鼠颈动脉球囊损伤模型；步骤二，在第1,3,7和14天观察新生内膜增生的病理过程；步骤三，每天通过灌胃法给予大鼠Nar25mg/kg/d，50mg/kg/d和100mg/kg/d或等体积的CMC-Na，持续14天；步骤四，对实验进行检测。进一步，测方法包括：小动物超声检测：使用B-Mode观察测量血管中内膜厚度(IMT)，其具有用于颈动脉的30MHz峰值小动物超声探头；获得至少三次连续搏动的舒张末期纵向图像，待近壁和远壁的内膜形态清晰可见，使用数字化刻度标尺手动测量。进一步，检测方法进一步包括：组织病理学形态检查：HE染色用于组织病理学形态检查。通过IX53显微镜分析切片的数字化图像，并使用CellSens成像软件以100x放大率和200x放大率进行分析：测量新内膜面积(NIA)，中膜面积(MA)和内弹力板包绕面积(IELA)，并计算NIA/MA比率和NIA/IELA比率。进一步，检测方法进一步包括：免疫组化：组织用4％多聚甲醛固定后，将5μm石蜡切片与PCNA抗体和CD163抗体在4℃下孵育过夜；将切片与第二抗体在37℃温育1小时，用DAB染色并用苏木精复染，然后拍片观察。本专利技术的另一目的在于提供一种对通过调控RIP1-RIP3-MLKL信号通路减轻球囊损伤后血管再狭窄的药物的检测方法包括：ELISA测定：测定血清样品中IL-1β和TNF-α的表达；所有程序均按照试剂盒说明书操作。进一步，检测方法进一步包括：生化检测：通过比色法检测氧化应激相关因子的水平；SOD活性，MDA和GSH含量试剂盒用于血清的生化检测。进一步，检测方法进一步包括：实时定量RT-qPCR测定：使用trizol试剂盒提取总RNA，然后根据使用primeScriptTM逆转录试剂盒将4.0mgRNA逆转录成cDNA；使用iQTMSYBRGreenSupermix进行实时定量RT-qPCR。进一步，PCR扩增条件为94℃×3分钟和40个循环(94℃×15秒，60℃×20秒和72×℃40秒)。本专利技术的优点及积极效果为：本专利技术采用2F球囊诱导雄性大鼠颈动脉球囊损伤模型，并在第1，3，7和14天观察新生内膜增生的病理过程。随后，每天通过灌胃法给予大鼠Nar(25，50和100mg/kg/d)或等体积的CMC-Na，持续14天。超声检查和组织病理学检查显示，Nar剂量依赖性地抑制球囊导管诱导的内膜增生，Nar可减少中内膜厚度(IMT)、新生内膜面积(NIA)、新生内膜面积/中膜面积(NIA/MA)和新生内膜面积/内弹力板包绕面积(NIA/IELA)。免疫组织化学显示Nar降低了PCNA的蛋白表达。在主动脉内膜中存在高表达的CD163，这表明在球囊损伤后发生炎性损伤。ELISA结果表明，Nar显着降低白细胞介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的过量产生。通过检测超氧化物歧化酶(SOD)的活性以及丙二醛(MDA)和谷胱甘肽(GSH)的水平，发现Nar可以防止球囊损伤引起的氧化应激。另外，RT-qPCR证明通过Nar处理进一步下调受体相互作用蛋白激酶(RIP1)，受体相互作用蛋白3(RIP3)和混合谱系激酶结构域样(MLKL)mRNA表达。这些结果表明，Nar可通过抑制炎症因子的释放来抑制球囊损伤引起的血管内膜增生，这可能与调控RIP1-RIP3-MLKL信号通路有关。附图说明图1是本专利技术实施提供的大鼠模型构建方法流程图。图2是本专利技术实施提供的球囊损伤后大鼠颈动脉内膜增生的进展图。(A)(C)小动物超声检测球囊损伤后颈总动脉的中内膜厚度(n＝3)。箭头表示中内膜的位置。(B)与假手术组相比，在球囊损伤后1,3,7和14天的颈总动脉的HE染色(n＝6或10)，以100×本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种通过调控RIP1‑RIP3‑MLKL信号通路减轻球囊损伤后血管再狭窄的药物，其特征在于，所述通过调控RIP1‑RIP3‑MLKL信号通路减轻球囊损伤后血管再狭窄的药物为柚皮素。

【技术特征摘要】
1.一种通过调控RIP1-RIP3-MLKL信号通路减轻球囊损伤后血管再狭窄的药物，其特征在于，所述通过调控RIP1-RIP3-MLKL信号通路减轻球囊损伤后血管再狭窄的药物为柚皮素。2.一种验证权利要求1所述通过调控RIP1-RIP3-MLKL信号通路减轻球囊损伤后血管再狭窄的药物药效的大鼠模型的构建方法，其特征在于，所述大鼠模型的构建方法包括以下步骤：步骤一，采用2F球囊诱导雄性大鼠颈动脉球囊损伤模型；步骤二，在第1，3，7和14天观察新生内膜增生的病理过程；步骤三，每天通过灌胃法给予大鼠Nar25mg/kg/d，50mg/kg/d和100mg/kg/d或等体积的CMC-Na，持续14天；步骤四，进行检测。3.如权利要求2所述的大鼠模型的构建方法，其特征在于，检测方法包括：小动物超声检测：使用B-Mode观察测量血管中内膜厚度IMT，具有用于颈动脉的30MHz峰值小动物超声探头；获得至少三次连续搏动的舒张末期纵向图像，待近壁和远壁的内膜形态清晰，使用数字化刻度标尺手动测量。4.如权利要求2所述的大鼠模型的构建方法，其特征在于，检测方法进一步包括：组织病理学形态检查：HE染色用于组织病理学形态检查；通过IX53显微镜分析切片的数字化图像，并使用CellSens成像软件以100x放大率和200x放大率进行分析：测量新内膜面积NIA，中膜面积MA和内弹力板包绕面积IELA，并计算NIA/MA比率和NIA/IELA比率。5.如权利要求2所述的大鼠模型的构建方法，其特征在于，检测方法进一步包括：免疫组化：组织用4％多聚甲醛固定后，将5μm石蜡切片与PCNA抗体和CD163...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄波，胡培，徐尚福，李利生，吴芹，石京山，
申请(专利权)人：遵义医学院，
类型：发明
国别省市：贵州,52