一种定量检测茶树籽三萜皂苷的UPLC-UV-QTOF-MS/MS方法技术

本发明专利技术属于天然产物检测技术领域，具体涉及一种对茶树籽(Camellia sinensis(L.)O.Kuntze)中三萜类皂苷的UPLC‑PDA‑MS/MS的定量检测方法。一种定量检测茶树籽三萜皂苷的UPLC‑UV‑QTOF‑MS/MS方法，包括如下步骤：(1)取待测样品预处理；(2)取茶树籽中已知的任意1个或多个皂素化合物，制备标准品溶液；(3)将供试品溶液和标准品溶液高效液相色谱/紫外/质谱联用设备(UPLC‑PDA‑QTOF‑MS/MS)，采用串联质谱进行结构鉴定，采用外标法在PDA检测器下进行定量检测。本发明专利技术定量结果更加准确；灵敏度高；样品需要量少。

A UPLC-UV-QTOF-MS/MS Method for Quantitative Detection of Triterpenoid Saponins in Tea Seeds

The invention belongs to the field of natural product detection technology, in particular to a quantitative detection method of UPLC PDA MS / MS for triterpenoid saponins in tea tree seeds (Camellia sinensis (L.) O. Kuntze). A UPLC UV QTOF MS/MS method for quantitative determination of triterpenoid saponins in tea seeds is described, which includes the following steps: (1) sample pretreatment; (2) extraction of any one or more saponin compounds known in tea seeds to prepare standard solution; (3) high performance liquid chromatography/ultraviolet/mass spectrometry (UPLC PDA QTOF MS/MS) for sample solution and standard solution. Structural identification was carried out and quantitative detection was carried out with external standard method under PDA detector. The method has the advantages of more accurate quantitative results, high sensitivity and less sample requirement.

【技术实现步骤摘要】
一种定量检测茶树籽三萜皂苷的UPLC-UV-QTOF-MS/MS方法
本专利技术属于天然产物检测
，具体涉及一种对茶树籽(Camelliasinensis(L.)O.Kuntze)中三萜类皂苷的UPLC-PDA-MS/MS的定量检测方法。
技术介绍
茶树籽(Camelliasinensis(L.)O.Kuntze)具有多种生物活性，被认为是继茶叶之后的茶树另一重要资源。特别是其中的三萜皂素，不仅具有良好的表面活性和去污能力，还具有抗菌消炎、抗肿瘤、改善酒精引起的肠胃损伤、抑制胃排空、促进植物对微量元素的吸收等生物药理功能。目前已从中国、日本、印度、斯里兰卡等国家的茶树种子种先后分离到50多种三萜皂素类物质，但结构相似，极性相近，为分离纯化和检测鉴定带来的很大困难，严重阻碍了对这类化合物的深入研究和开发应用。目前对茶树籽皂素的检测尚没有理想的定量检测方法。《出口茶皂素中皂甙含量的测定》(进出口行业标准SN/T1852-2006)采用重量法，即先测得皂苷元质量，再换算成皂苷质量分数。该法只适合测含量为30％-70％的茶皂苷样品，样品需要量较大，耗时长，误差大，不适合少量样品的检测。浓硫酸(或高氯酸)-香草醛比色法是测定皂素的常用方法，但是容易受到样品中其他杂质的干扰，使检测结果偏高；另外无法准确定量皂素单体化合物。目前急需建立一套针对茶籽皂素的有效的定量检测方法，以利于今后的研究和产品开发。
技术实现思路
：本专利技术要解决的问题是建立一种UPLC-UV-QTOF-MS/MS(超高效液相色谱-紫外-四级杆串联飞行时间质谱联用)的检测方法，对茶树籽中的皂素进行定量检测。一种定量检测茶树籽三萜皂苷的UPLC-UV-QTOF-MS/MS方法，包括如下步骤：(1)取待测样品干燥磨碎，过筛，以甲醇或乙醇水溶液提取，可直接用于检测；或将粗提取液浓缩后经过正己烷或石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，将正丁醇相进一步用大孔树脂或沉淀法纯化总皂素部分，再进行检测；(2)取茶树籽中已知的任意1个或多个皂素化合物，制备标准品溶液；(3)将供试品溶液和标准品溶液高效液相色谱/紫外/质谱联用设备(UPLC-PDA-QTOF-MS/MS)，采用串联质谱进行结构鉴定，采用外标法在PDA检测器下进行定量检测：色谱柱为ACQUITYUPLCHSST3色谱柱(1.8μm,150mm×2.1mmi.d.,Waters)；色谱条件为：流动相A(0.1％甲酸/水)，B相(0.1％甲酸/乙腈)；梯度洗脱，0-4min,梯度洗脱，(32-35％)–(35-38％)B；4-32min,等度洗脱(35-38％)B；32-58min,梯度洗脱，(35-38％)–(43-48％)B；58-60min,等度洗脱，(32-35％)B。柱温，25℃；流速，0.2-0.3mL/min；进样量，5μL；检测波长：205-215nm。质谱条件为：采用负离子扫描模式；扫描范围：m/z100-2000；雾化气(GS1)：50psi；雾化气(GS2)：50psi；气帘气(CUR)：35psi；离子源温度(TEM)：500℃；离子源电压(IS)：-4500V；一级扫描：去簇电压(DP)：100V；聚焦电压(CE)：10V；二级扫描：使用TOFMS～ProductIon～IDA模式采集质谱数据，CID能量为40、60和80V，进样前，用CDS做质量轴校正。优选的，其中，步骤(1)中，甲醇或乙醇水溶液中醇浓度为60-80％，料液比为1:10-1:20，提取温度为70-90℃，提取方法为回流、超声、浸渍、渗漉、逆流。正己烷或石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取时比例各为1:1,3次；大孔树脂选用D101、AB-8等适用于中等极性化合物分离的树脂；洗脱采用20-95％的乙醇溶液进行梯度洗脱，每个浓度洗脱2-3个柱体积，收集50-70％乙醇洗脱部分作为总皂素；或将正丁醇相浓缩后采用甲醇或乙醇反复沉淀法得到总皂素。步骤(2)中，以茶树种子中发现的皂素Theasaponins、Assamsaponins、Teaseedsaponins、Floratheasaponins、Camelliasaponins中的一个或多个皂素单体作为标准品，制作标准曲线，进行定量。步骤(3)中，采用ACQUITYUPLCHSST3色谱柱(1.8μm,150mm×2.1mmi.d.,Waters)色谱柱。步骤(3)中，色谱条件为：流动相A(0.1％甲酸/水)，B相(0.1％甲酸/乙腈)；梯度洗脱，0-4min,梯度洗脱，(32-35％)–(35-38％)B；4-32min,等度洗脱(35-38％)B；32-58min,梯度洗脱，(35-38％)–(43-48％)B；58-60min,等度洗脱，(32-35％)B。柱温，25℃；流速，0.2-0.3mL/min；进样量，5μL；检测波长：205-215nm。步骤(3)中，质谱条件为：采用负离子扫描模式；扫描范围：m/z100-2000；雾化气(GS1)：50psi；雾化气(GS2)：50psi；气帘气(CUR)：35psi；离子源温度(TEM)：500℃；离子源电压(IS)：-4500V；一级扫描：去簇电压(DP)：100V；聚焦电压(CE)：10V；二级扫描：使用TOFMS～ProductIon～IDA模式采集质谱数据，CID能量为40、60和80V，进样前，用CDS做质量轴校正。该方法具体包括下列步骤：(1)待测样品制备及前处理：茶籽去壳，将籽仁磨碎，过20目筛，按照1:10-1:20比例加入60-80％甲醇或乙醇，70-90℃条件下提取3-8h，提取方法为回流、超声、浸渍、渗漉、逆流。趁热抽滤得到粗提液。上述醇粗提液进行旋转蒸发浓缩，真空冷冻干燥机冻干成粉末，0℃以下冰箱保存备用。样品配成一定浓度水或甲醇溶液，过0.22μm滤膜，即得供试液。粗提取物粉末也可进一步进行总皂素部分的富集，采用正己烷(或石油醚)、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取3次，收集正丁醇相；大孔树脂选用D101、AB-8等适用于中等极性化合物分离的树脂；洗脱采用20-95％的乙醇溶液进行梯度洗脱，每个浓度洗脱2-3个柱体积，收集50-70％乙醇洗脱部分作为总皂素；或将正丁醇相浓缩后采用甲醇或乙醇反复沉淀法得到总皂素。得到总皂素部分。(2)样品检测：采用AcquityTMultra型高效液相色谱仪(美国Waters公司)，TripleTOF5600+型飞行时间质谱，ACQUITYUPLCHSST3色谱柱(1.8μm,150mm×2.1mmi.d.,Waters)色谱柱。色谱条件为：流动相A(0.1％甲酸/水)，B相(0.1％甲酸/乙腈)；梯度洗脱，0-4min,梯度洗脱，(32-35％)–(35-38％)B；4-32min,等度洗脱(35-38％)B；32-58min,梯度洗脱，(35-38％)–(43-48％)B；58-60min,等度洗脱，(32-35％)B。柱温，25℃；流速，0.2-0.3mL/min；进样量，5μL；检测波长：205-215nm。质谱条件为：采用负离子扫描模式；扫描范围：m/z100-2000；雾化气(GS1)：50psi；雾化气(GS2)：50psi；气帘气(CUR)：35psi；本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种定量检测茶树籽三萜皂苷的UPLC‑UV‑QTOF‑MS/MS方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)取待测样品干燥磨碎，过筛，以甲醇或乙醇水溶液提取，可直接用于检测；或将粗提取液浓缩后经过正己烷或石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，将正丁醇相进一步用大孔树脂或沉淀法纯化总皂素部分，再进行检测；(2)取茶树籽中已知的任意1个或多个皂素化合物，制备标准品溶液；(3)将供试品溶液和标准品溶液高效液相色谱/紫外/质谱联用设备(UPLC‑PDA‑QTOF‑MS/MS)，采用串联质谱进行结构鉴定，采用外标法在PDA检测器下进行定量检测：色谱柱为ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱(1.8μm,150mm×2.1mm i.d.,Waters)；色谱条件为：流动相A(0.1％甲酸/水)，B相(0.1％甲酸/乙腈)；梯度洗脱，0‑4min,梯度洗脱，(32‑35％)–(35‑38％)B；4‑32min,等度洗脱(35‑38％)B；32‑58min,梯度洗脱，(35‑38％)–(43‑48％)B；58‑60min,等度洗脱，(32‑35％)B。柱温，25℃；流速，0.2‑0.3mL/min；进样量，5μL；检测波长：205‑215nm。质谱条件为：采用负离子扫描模式；扫描范围：m/z 100‑2000；雾化气(GS1)：50psi；雾化气(GS2)：50psi；气帘气(CUR)：35psi；离子源温度(TEM)：500℃；离子源电压(IS)：‑4500V；一级扫描：去簇电压(DP)：100V；聚焦电压(CE)：10V；二级扫描：使用TOF MS～Product Ion～IDA模式采集质谱数据，CID能量为40、60和80V，进样前，用CDS做质量轴校正。...

【技术特征摘要】
1.一种定量检测茶树籽三萜皂苷的UPLC-UV-QTOF-MS/MS方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)取待测样品干燥磨碎，过筛，以甲醇或乙醇水溶液提取，可直接用于检测；或将粗提取液浓缩后经过正己烷或石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，将正丁醇相进一步用大孔树脂或沉淀法纯化总皂素部分，再进行检测；(2)取茶树籽中已知的任意1个或多个皂素化合物，制备标准品溶液；(3)将供试品溶液和标准品溶液高效液相色谱/紫外/质谱联用设备(UPLC-PDA-QTOF-MS/MS)，采用串联质谱进行结构鉴定，采用外标法在PDA检测器下进行定量检测：色谱柱为ACQUITYUPLCHSST3色谱柱(1.8μm,150mm×2.1mmi.d.,Waters)；色谱条件为：流动相A(0.1％甲酸/水)，B相(0.1％甲酸/乙腈)；梯度洗脱，0-4min,梯度洗脱，(32-35％)–(35-38％)B；4-32min,等度洗脱(35-38％)B；32-58min,梯度洗脱，(35-38％)–(43-48％)B；58-60min,等度洗脱，(32-35％)B。柱温，25℃；流速，0.2-0.3mL/min；进样量，5μL；检测波长：205-215nm。质谱条件为：采用负离子扫描模式；扫描范围：m/z100-2000；雾化气(GS1)：50psi；雾化气(GS2)：50psi；气帘气(CUR)：35psi；离子源温度(TEM)：500℃；离子源电压(IS)：-4500V；一级扫描：去簇电压(DP)：100V；聚焦电压(CE)：10V；二级扫描：使用TOFMS～ProductIon～IDA模式采集质谱数据，CID能量为40、60和80V，进样前，用CDS做质量轴校正。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，甲醇或乙醇水溶液中醇浓度为60-80％，料液比为1:10-1:20，提取温度为70-90℃，提取方法为回流、超声、浸渍、渗漉、逆流。3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(...

【专利技术属性】
技术研发人员：李博，屠幼英，吴学进，吴嘉璠，刘亚文，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33