增加蛋白桑中1-脱氧野尻霉素提取量的发酵处理方法技术

本发明专利技术提供了一种增加蛋白桑中1‑脱氧野尻霉素提取量的发酵处理方法，包括以下步骤：步骤1，培养基配制；YPD固体培养基，LB固体培养基，MRS固体培养基。步骤2，酵母菌发酵液体菌制备：枯草芽孢杆菌发酵液体菌制备：植物乳杆菌发酵液体菌制备：步骤3，准确蛋白桑粉，以步骤2制作的发酵液为发酵菌种，按照菌种体积比组合酵母菌、枯草芽孢杆菌、草芽孢杆菌的其中一种或几种发酵；发酵水分为40～60％、发酵温度为25～35℃、发酵时间为24～72h。本发明专利技术优点在于：用微生物发酵的处理方式对蛋白桑进行预处理，不消耗能源，不产生粉尘、废液等污染，更主要的是能够提高DNJ提取量和蛋白桑资源的利用效果。

Fermentation Processing Method for Increasing the Extraction Quantity of 1-Deoxynojirimycin from Protein Mulberry

The present invention provides a fermentation treatment method for increasing the extraction amount of 1 deoxynojirimycin in protein mulberry, including the following steps: step 1, preparation of culture medium; YPD solid culture medium, LB solid culture medium, MRS solid culture medium. Step 2: Yeast fermentation liquid bacteria preparation: Bacillus subtilis fermentation liquid bacteria preparation: Lactobacillus plantarum fermentation liquid bacteria preparation: Step 3, accurate protein mulberry powder, step 2 fermentation liquid as fermentation bacteria, according to the volume ratio of yeast, Bacillus subtilis, Bacillus subtilis, one or several fermentation; fermentation water 40-60%, fermentation temperature The fermentation time was 24-72 h at 25-35 C. The invention has the advantages of: pretreatment of protein mulberry by microbial fermentation, no energy consumption, no pollution such as dust and waste liquid, and more importantly, it can improve the extraction amount of DNJ and the utilization effect of protein mulberry resources.

【技术实现步骤摘要】
增加蛋白桑中1-脱氧野尻霉素提取量的发酵处理方法
本专利技术涉及发酵处理
，特别涉及一种增加蛋白桑中1-脱氧野尻霉素(DNJ)提取量的发酵处理方法。
技术介绍
我国地域辽阔，桑树资源丰富，分布广泛，是世界上桑树种类最多的国家。蛋白桑属于桑树属(Morus)，是由全国各地收集的28个桑树品种经过长期选择与改良，杂交优化而得的新品系。现代药理学研究已经表明，桑叶中的生物碱类、黄酮类和多糖类均具有降血糖的作用。桑树中有多种生物碱成分，其中的1-脱氧野尻霉素(1-Deoxynojirimycin，DNJ)一种多羟基生物碱，是降血糖的主要活性成分，具有明显的降血糖作用。DNJ能够抑制α-糖苷酶的活性，通过降低小肠对糖类物质的分解和吸收，同时能够促进胰岛素分泌，从而达到降低血糖的作用，是一种治疗糖尿病的有效药物。此外，还具有抗病毒、抑制肿瘤转移，降血压，降血脂等功效，具有非常高的食用和药用价值。目前，桑叶中DNJ的提取量受多种因素影响，其中样品的预处理方式能够对DNJ的提取量造成影响。已有的处理方法如微波、加热等。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的缺陷，提供了一种增加蛋白桑中1-脱氧野尻霉素提取量的发酵处理方法，能有效的解决上述现有技术存在的问题。为了实现以上专利技术目的，本专利技术采取的技术方案如下：一种增加蛋白桑中1-脱氧野尻霉素提取量的发酵处理方法，包括以下步骤：步骤1，培养基配制；YPD固体培养基：蛋白胨2g，葡萄糖2g，酵母膏1g，固体培养基添加琼脂2g，灭菌备用。用于培养酵母菌种。LB固体培养基：NaCl1g，蛋白胨1g，酵母膏0.5g，固体培养基添加琼脂粉2g，灭菌备用。用于培养枯草芽孢杆菌菌种。MRS固体培养基：葡萄糖2g，乙酸钠0.75g，蛋白胨1.5g，硫酸镁0.03g，牛肉膏1.5g，柠檬酸铵0.2g，酵母膏0.75g，磷酸氢二钾0.2g，固体培养基添加琼脂粉2g，灭菌备用。用于培养植物乳杆菌菌种。步骤2，发酵液体菌种制备；酵母菌制备：用接种环从实验室斜面培养基上挑取一个酿酒酵母的单菌落，置于装有5mL液体培养基的试管中，30℃，200r/min转速下震荡培养培养12h，按照2％的体积比接种到装液量20％的三角瓶液体培养基中，继续摇床培养12h左右，至活菌数1×109CFU/mL，收集酵母菌发酵液备用。枯草芽孢杆菌制备：用接种环从实验室斜面培养基上挑取一个枯草芽孢杆菌的单菌落，置于装有5mL液体培养基的试管中，37℃，200r/min转速震荡培养12h，按照2％的比例接种到装液量20％的三角瓶液体培养基中，继续摇床培养12小时，至活菌数5×109CFU/mL，收集枯草芽孢杆菌发酵液备用。植物乳杆菌制备：用接种环从实验室斜面培养基上挑取一个植物乳杆菌的单菌落，置于装有5mL液体培养基的试管中，37℃，密闭静置培养12h，按照2％的比例接种到装液量90％的三角瓶液体培养基中，静置培养12小时，至活菌数5×109CFU/mL，收集植物乳杆菌发酵液备用。步骤3，准确称取50g的自然晒干蛋白桑粉，放置于500mL锥形瓶中。以步骤2制作的发酵液为发酵菌种，按照菌种体积比组合酵母菌、枯草芽孢杆菌、草芽孢杆菌的其中一种或几种发酵；发酵水分为40～60％、发酵温度为25～35℃、发酵时间为24～72h。作为优选，发酵菌种为枯草芽孢杆菌和酵母，发酵水分40％，发酵温度35℃，发酵时间72h。作为优选，发酵菌种为产朊假丝酵母和枯草芽孢杆菌，接种量10％(2个液体菌种体积比1:1)，发酵水分40％，发酵温度35℃，发酵时间72h。与现有技术相比本专利技术的优点在于：用微生物发酵的处理方式对蛋白桑进行预处理，不消耗能源，不产生粉尘、废液等污染，更主要的是能够提高DNJ提取量和蛋白桑资源的利用效果。附图说明图1是本专利技术实施例高效液相色谱图；图1a为DNJ标准品色谱图；图1b为样品色谱图；图2是本专利技术实施例DNJ标准曲线图。具体实施方式为使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图并列举实施例，对本专利技术做进一步详细说明。材料蛋白桑采自河南汝州市河南宏翔生物科技有限公司蛋白桑种植基地。菌种：产朊假丝酵母(C.utilis，CICC32211)，枯草芽孢杆菌(B.subtilis，LN)、植物乳杆菌(L.plantarum，BNCC192567)均为河南科技大学宏翔生物饲料实验室保存，使用前活化。DNJ标准品(Sigma公司)，FMOC-Cl(上海谱振生物科技有限公司)，乙腈(默克公司)，其他试剂均为分析纯，实验用水为蒸馏水。高效液相色谱仪荧光检测器(美国waters公司)，台式冷冻高速离心机(美国ThermoFisher公司)，电热恒温水浴箱(上海一恒科学仪器有限公司)。培养基配制YPD固体培养基(100ml)：蛋白胨2g，葡萄糖2g，酵母膏1g，固体培养基添加琼脂2g，灭菌备用。用于培养酵母菌种。LB固体培养基(100ml)：NaCl1g，蛋白胨1g，酵母膏0.5g，固体培养基添加琼脂粉2g，灭菌备用。用于培养枯草芽孢杆菌菌种。MRS固体培养基(100ml)：葡萄糖2g，乙酸钠0.75g，蛋白胨1.5g，硫酸镁0.03g，牛肉膏1.5g，柠檬酸铵0.2g，酵母膏0.75g，磷酸氢二钾0.2g，固体培养基添加琼脂粉2g，灭菌备用。用于培养植物乳杆菌菌种。发酵液体菌种制备酵母菌制备：用接种环从实验室斜面培养基上挑取一个酿酒酵母的单菌落，置于装有5mL液体培养基的试管中，30℃，200r/min转速下震荡培养培养12h，按照2％的体积比接种到装液量20％的三角瓶液体培养基中，继续摇床培养12h左右，至活菌数1×109CFU/mL，收集发酵液备用。枯草芽孢杆菌制备：用接种环从实验室斜面培养基上挑取一个枯草芽孢杆菌的单菌落，置于装有5mL液体培养基的试管中，37℃，200r/min转速震荡培养12h，按照2％的比例接种到装液量20％的三角瓶液体培养基中，继续摇床培养12小时，至活菌数5×109CFU/mL，收集发酵液备用。植物乳杆菌制备：用接种环从实验室斜面培养基上挑取一个植物乳杆菌的单菌落，置于装有5mL液体培养基的试管中，37℃，密闭静置培养12h，按照2％的比例接种到装液量90％的三角瓶液体培养基中，静置培养12小时，至活菌数5×109CFU/mL，收集发酵液备用。DNJ的和测定乙醇提取法：准确称取0.5g蛋白桑样品粉放置于圆底烧瓶，加入一定量的70％乙醇，加热回流提取2次，每次2h，合并两次滤液定容至100mL，备用。采用高效液相色谱法(HighPerformanceLiquidChromatography，HPLC)，并参照欧阳臻,陈钧(不同季节桑叶中1-脱氧野尻霉素(DNJ)含量的测定.食品科学,2004,25(10):211-214.)进行测定。DNJ的衍生化：取提取液10μL置于1.5mL离心管，加入10μL硼酸盐缓冲液(PH＝8.5)混合，在加入5mmol/L的FMOC-Cl乙腈混合液20μL，均匀混合后于20℃水浴条件下反映20min，然后加入0.1mol/L甘氨酸10μL与剩余的衍生化试剂反应，终止反应。最后，加入0.1％的醋酸水溶液950μL稀释，混合均匀后用0.45μm一次性无菌针头过滤器过本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种增加蛋白桑中1‑脱氧野尻霉素提取量的发酵处理方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，培养基配制；YPD固体培养基：蛋白胨2g，葡萄糖2g，酵母膏1g，固体培养基添加琼脂2g，灭菌备用；用于培养酵母菌种；LB固体培养基：NaCl1g，蛋白胨1g，酵母膏0.5g，固体培养基添加琼脂粉2g，灭菌备用；用于培养枯草芽孢杆菌菌种；MRS固体培养基：葡萄糖2g，乙酸钠0.75g，蛋白胨1.5g，硫酸镁0.03g，牛肉膏1.5g，柠檬酸铵0.2g，酵母膏0.75g，磷酸氢二钾0.2g，固体培养基添加琼脂粉2g，灭菌备用；用于培养植物乳杆菌菌种；步骤2，发酵液体菌种制备；酵母菌制备：用接种环从实验室斜面培养基上挑取一个酿酒酵母的单菌落，置于装有5mL液体培养基的试管中，30℃，200r/min转速下震荡培养培养12h，按照2％的体积比接种到装液量20％的三角瓶液体培养基中，继续摇床培养12h左右，至活菌数1×10

【技术特征摘要】
1.一种增加蛋白桑中1-脱氧野尻霉素提取量的发酵处理方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，培养基配制；YPD固体培养基：蛋白胨2g，葡萄糖2g，酵母膏1g，固体培养基添加琼脂2g，灭菌备用；用于培养酵母菌种；LB固体培养基：NaCl1g，蛋白胨1g，酵母膏0.5g，固体培养基添加琼脂粉2g，灭菌备用；用于培养枯草芽孢杆菌菌种；MRS固体培养基：葡萄糖2g，乙酸钠0.75g，蛋白胨1.5g，硫酸镁0.03g，牛肉膏1.5g，柠檬酸铵0.2g，酵母膏0.75g，磷酸氢二钾0.2g，固体培养基添加琼脂粉2g，灭菌备用；用于培养植物乳杆菌菌种；步骤2，发酵液体菌种制备；酵母菌制备：用接种环从实验室斜面培养基上挑取一个酿酒酵母的单菌落，置于装有5mL液体培养基的试管中，30℃，200r/min转速下震荡培养培养12h，按照2％的体积比接种到装液量20％的三角瓶液体培养基中，继续摇床培养12h左右，至活菌数1×109CFU/mL，收集酵母菌发酵液备用；枯草芽孢杆菌制备：用接种环从实验室斜面培养基上挑取一个枯草芽孢杆菌的单菌落，置于装有5mL液体培养基的试管中，37℃...

【专利技术属性】
技术研发人员：李旺，李元晓，何万领，曹平华，赵龙妹，
申请(专利权)人：河南科技大学，
类型：发明
国别省市：河南,41