超量表达白菜MYB55在甘蓝型油菜分子育种中的应用制造技术

本发明专利技术公开了超量表达白菜MYB55在甘蓝型油菜分子育种中的应用，通过构建正义超量表达植物载体，转化黑籽甘蓝型油菜品种中双10号后，获得转基因阳性植株；转基因阳性植株发育明显滞后，植株高度在盛花期前明显低于对照植株，但是转基因植株的横向生长发达；转基因植株的生殖生长较对照野生型植株延迟3‑5天，但是花、蕾和角果数增加，从而整个转基因植株的产量增加。对转基因植株进行组织解剖学观察发现，转基因植株茎秆维管束变大、木质部变厚且面积更大，抗折力增加；另外对转基因植株茎秆接种核盘菌，病斑显著比野生型植株小，以上结果说明BrMYB55参与植物的生长发育，增加了产量以及参与植物抗倒和抗菌核病过程。

Application of MYB55 Overexpression in Molecular Breeding of Brassica napus

The invention discloses the application of overexpressing Chinese cabbage MYB55 in molecular breeding of Brassica napus. After transforming black-seeded Brassica napus cultivar Zhongshuang 10 by constructing a just overexpressing plant vector, the transgenic positive plants are obtained; the development of the transgenic positive plants is obviously lagged, and the plant height is obviously lower than that of the control plants before flowering, but the transverse growth of the transgenic plants is developed. The reproductive growth of the transgenic plants was delayed by 3 to 5 days compared with the control wild type plants, but the number of flowers, buds and horns increased, thus the yield of the whole transgenic plants increased. The histological and anatomical observation of the transgenic plants showed that the vascular bundles of the stem became larger, the xylem became thicker and larger, and the bending resistance increased. In addition, the disease spots of the transgenic plants inoculated with Sclerotinia sclerotiorum were significantly smaller than those of the wild plants. The above results showed that BrMYB55 participated in the growth and development of plants, increased yield and participated in the process of plant lodging resistance and Sclerotinia sclerotiorum resistance.

【技术实现步骤摘要】
超量表达白菜MYB55在甘蓝型油菜分子育种中的应用
本专利技术涉及基因工程
，特别涉及超量表达白菜(Brassicarapa)MYB55在甘蓝型油菜分子育种中的应用，改善甘蓝型油菜生长发育、增产、抗倒和抗病。
技术介绍
白菜起源于中国，是我国最重要的蔬菜和油用作物之一,由于它具有复杂的遗传基础,使得一些重要农艺性状的改良非常困难。众多研究表明,有限的材料类型和标记数量使得白菜类作物的遗传多样性研究不够全面,许多里要形态生理性状和植酸含童等营养品质性状遗传规律缺乏系统分析。有必要从分子水平上探讨相关性状的遗传变异,为发掘并利用关键性基因源奠定基础。白菜属于十字花科，模式植物拟南芥也属于十字花科。所以，模式植物拟南芥功能基因组学的研究成果，可以推动白菜重要性状的分子机理研究。目前，整个植物界对MYB55基因的研究都不全面和深刻。前人研究发现拟南芥AtMYB55在叶片基底细胞相对表达较高，推测其可能和叶片形态建成有关；AllisonGaudinier等人研究通过酵母单杂技术发现在根柱及根中AtMYB55与AtIRX11互作，而AtIRXII基因已被证实受SND1和MYB46上调，所以推测AtMYB55可能参与次生细胞壁的生物合成；HidekiGoda等人的报道显示在拟南芥中AtMYB55受生长素和油菜素内酯的调控。以上研究都表明AtMYB55能够改善拟南芥的生长发育。另外，JianweiZhao等人发现用核盘菌处理油菜后，引起了MYB55的显著上调，推测MYB55参与油菜抗菌核病过程。但是，目前白菜MYB55基因的成员数、蛋白特征、进化关系、表达的组织特异性、与生长发育、增产、抗倒和抗病的关系和在基因工程中的应用等都未见报道。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的之一在于提供一种超量表达白菜MYB55在改善甘蓝型油菜生长发育指标中的应用；本专利技术的目的之二在于提供超量表达白菜MYB55在提高甘蓝型油菜产量中的应用；本专利技术的目的之三在于提供超量表达白菜MYB55在提高甘蓝型油菜抗倒中的应用。本专利技术的目的之四在于提供超量表达白菜MYB55在提高甘蓝型油菜抵抗菌核病中的应用。为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：1、超量表达白菜MYB55在改善甘蓝型油菜生长发育指标中的应用，其特征在于：所述白菜MYB55的氨基酸序列如SEQIDNo.13所示。优选的，所述白菜MYB55的全长cDNA序列如SEQIDNo.11所示。优选的，所述白菜MYB55的基因组序列如SEQIDNo.12所示。优选的，改善生长发育指标为根变长变粗、茎变粗或叶变大、花数增加、蕾数增加和角果数增加中的至少一种。优选的，所述超量表达白菜MYB55的方法为将白菜MYB55基因构建正义超量表达植物表达载体，然后构建转化体转化甘蓝型油菜，筛选转基因植株即获得超量表达白菜MYB55的甘蓝型油菜。优选的，所述植物表达载体由SEQIDNO.11所示的151-1161bp插入pFGC5941M载体的CaMV35S启动子和OCS终止子之间而得。优选的，所述转化子为含所述植物表达载体的根癌农杆菌LBA4404。2、超量表达白菜MYB55在提高甘蓝型油菜产量中的应用。3、超量表达白菜MYB55在提高甘蓝型油菜抗倒或/和抵抗菌核病中的应用。4、一种获得高产、抗倒抗病和生长发育优良的甘蓝型油菜的方法，包括如下步骤：将SEQIDNO.11所示的151-1161bp插入pFGC5941M载体的CaMV35S启动子和OCS终止子之间获得超量表达甘蓝MYB55的植物表达载体，然后转化农杆菌获得工程菌，将获得的工程菌转化甘蓝型油菜宿主，筛选转基因植株即获得高产、抗倒抗病和生长发育优良的甘蓝型油菜。本专利技术的有益效果在于：本专利技术提供了MYB55基因在白菜的成员数及其全长cDNA序列和基因组序列、编码蛋白特征、进化关系、表达的器官组织特异性等，并确认了BrMYB55基因表达显著上调使甘蓝型油菜生长发育改善，如茎、根的木质部大大加厚，茎、根更粗，一次分枝数略有增加，二次分枝数大大增加；单株荚角数大大增加，单株产量大大提高，提高产量；转基因植株的茎秆木质部变厚，抗折力提升，再加上根系变得更发达，最终使转基因植株抗倒伏能力增加，另外对转基因植株茎秆接种核盘菌，病斑显著比野生型植株小。因此MYB55基因能够使甘蓝型油菜整体生长发育和株型在农学上有很大的改进，抗倒伏性大大提高，对油菜至今没有攻克的癌症性病害——菌核病的抗性大大提高，且性状的逆向变化即副作用很少，因此可用于甘蓝型油菜的分子育种。附图说明为了使本专利技术的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本专利技术提供如下附图进行说明：图1为白菜BrMYB55基因家族全长cDNA和基因组DNA扩增的电泳图(A：全长cDNA；B：基因组DNA)；图2为白菜BrMYB55二级结构，纵向从长到短的4种线段分别表示α螺旋、延伸链、β转角和随机卷曲，数字表示蛋白的氨基酸残基的计数。图3为BrMYB55蛋白的三级结构。图4为BrMYB55与拟南芥及其它物种MYB转录因子的系统发育的关系。图5为荧光定量RT-PCR分析MYB55基因家族表达组织性特征。图6为BrMYB55的超量表达载体图谱。图7为超量表达BrMYB55组培过程。图8为转基因植株PCR鉴定及其与对照植株表达水平的比较。图9为转基因植株生长发育表型变化。图10为转基因植株产量表型变化。图11为转基因植株组织解解剖结构变化(A：WT植株；B：超量表达BrMYB55转基因植株；A，B：500μm)。图12为转基因植株茎秆抗折力研究变化。图13为转基因植株抗病表型变化。具体实施方式以下将参照附图，对本专利技术的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。优选实施例采用的植物材料：白菜为spectrum春白菜，均由重庆市油菜工程技术研究中心提供，常规大田试验条件种植。黑籽油菜品种“中双10号”的种子由中国农业科学院油料作物研究所的张学昆研究员提供。优选实施例采用的试剂及试剂盒：EASYspin植物RNA快速提取试剂盒购自北京博迈德生物技术有限公司；PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser(PerfectRealTime)反转录试剂盒购自大连TaKaRa公司；荧光定量试剂盒FastStartEssentialDNAGreenMaster购自Roche公司；各种限制性内切酶XbaI、BamHI和SacI等为立陶宛MBIFermentas公司产品；Murashige&Skoog(MS)培养基购自荷兰Duchefa公司；GoldView核酸染料购自北京赛百盛基因技术有限公司；CTAB、TEbuffer、DNALoadingBuffer、利福平(Rif)、链霉素(Str)、卡那霉素(Kan)、氨苄青霉素(Amp)、头孢噻肟钠(Cef)、琼脂糖、胰蛋白胨、酵母提取物、asta除草剂均购自上海生工生物工程技术服务有限公司；优选实施例采用的主要仪器：美国AppliedBiosystems公司ABI9700型PCR仪，Bio本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.超量表达白菜MYB55在改善甘蓝型油菜生长发育指标中的应用，其特征在于：所述白菜MYB55的氨基酸序列如SEQ ID No.13所示。

【技术特征摘要】
1.超量表达白菜MYB55在改善甘蓝型油菜生长发育指标中的应用，其特征在于：所述白菜MYB55的氨基酸序列如SEQIDNo.13所示。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述白菜MYB55的全长cDNA序列如SEQIDNo.11所示。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述白菜MYB55的基因组序列如SEQIDNo.12所示。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：改善生长发育指标为根变长变粗、茎变粗或叶变大、花数增加、蕾数增加和角果数增加中的至少一种。5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述超量表达白菜MYB55的方法为将白菜MYB55基因构建正义超量表达植物表达载体，然后构建转化体转化甘蓝型油菜，筛选转基因植株即获得超量表达白菜MYB55的甘蓝型油菜。6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所...

【专利技术属性】
技术研发人员：柴友荣，蒋佳怡，尹能文，廖雪莉，张琳，袁成龙，蒋熳霖，杜有杰，谢瑞芳，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：重庆,50