一种易变山羊草苯丙氨酸解氨酶基因及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种易变山羊草苯丙氨酸解氨酶核酸序列及其应用，所述的易变山羊草苯丙氨酸解氨酶基因核酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术易变山羊草苯丙氨酸解氨酶基因编码一个苯丙氨酸解氨酶，抗禾谷孢囊线虫性能高，对小麦抗禾谷孢囊线虫育种具有重要参考和应用价值。

A Variable Phenylalanine Ammonia Lyase Gene from Aegilops chinensis and Its Application

The invention discloses a variable goat grass phenylalanine ammonia lyase nucleic acid sequence and its application. The variable goat grass phenylalanine ammonia lyase gene nucleic acid sequence is shown as SEQ ID NO.1. The variable goatgrass phenylalanine ammonia lyase gene of the invention encodes a phenylalanine ammonia lyase, which has high resistance to cereal cyst nematode and has important reference and application value for wheat breeding of cereal cyst nematode resistance.

【技术实现步骤摘要】
一种易变山羊草苯丙氨酸解氨酶基因及其应用
本专利技术涉及苯丙氨酸解氨酶领域，具体的涉及一种易变山羊草苯丙氨酸解氨酶核酸序列及其应用。
技术介绍
PAL(PhenylalanineAmmonia-Lyase，苯丙氨酸解氨酶)是苯丙烷代谢途径中的第一个酶，也是关键酶，它催化L-苯丙氨酸转化为反式肉桂酸。反式肉桂酸再经下游不同代谢分支，分别转化为花青素、木质素、黄酮类物质、植物抗毒素等次生代谢产物，其中一些物质被报道在植物抗病中起作用。植物中的PALs是由多基因家族编码的同源异构型蛋白，它们具有各自的表达特征且功能也不完全相同。1961年，Conn和Koukol首次在大麦幼苗中发现并分离纯化出了PAL，此后对PAL的研究逐渐展开，随着分离纯化方法技术的不断完善提高，已经成功的从其他植物中分离纯化出了PAL蛋白，如小麦，大豆，杨树等。PAL的表达和生物活性会随着生物发育变化、外界环境刺激发生改变。盐胁迫会激活百脉根PAL基因的表达，并导致酚类物质的积累。在烟草中，在NaCl、甘露醇、低温等处理条件下，PAL表达显著上调。低温处理黄瓜幼苗，PAL酶活性提高，促进苯丙烷类化合物的合成和细胞内的抗氧化酶对低温引起的过氧化物的清除。此外，PAL在植物免疫反应中也起着重要的作用。番茄在受到土豆孢囊线虫侵染后，番茄抗性品种中PAL基因表达显著上调，而感病品种中无明显变化。小麦在感染赤霉菌后，PAL基因表达与PAL酶大幅度增加。辣椒叶片在受到Xcv(Xanthomonascampestrispv.Vesicatoria)感染时，CaPAL1被诱导。CaPAL1沉默的辣椒植株，在受到致命性或者非致命性的Xcv侵染时，沉默植物表现为易感病型。而在拟南芥中过表达CaPAL1基因，过表达植株表现出对Pseudomonassyringaepv.tomato和Hyaloperonosporaarabidopsidis的抗性。大豆GmPAL2.1基因受大豆疫霉菌诱导显著上调，转GmPAL2.1基因的大豆植株抗Phytophthorasojae的抗性显著提高。PAL酶活性在转基因大豆植株中显著提高，在GmPAL2.1沉默植株中活性较低，同时检测发现在过表达GmPAL2.1大豆植株中，黄豆苷元(daidzein)，木黄酮(genistein)和SA(salicylicacid)含量显著增加，而这些物质的增加与GmPAL2.1基因在参与大豆调控对Phytophthorasojae的抗性中起积极的作用。虽然PAL的生物学功能不断被研究和报道，迄今为止，仍未报道PAL基因是否参与植物抗禾谷孢囊线虫反应。易变山羊草(Aegilopsvariabilis)是小麦的近缘物种，具有抗旱、抗条锈病、抗虫等特性，与小麦进行远源杂交时可产生可育后代，是小麦遗传改良的优异资源。易变山羊草对禾谷孢囊线虫(H.avenae,cerealcystnematode,CCN)、根结线虫(Meloidogyncnaasi)具有高的抗性。
技术实现思路
为了解决以上技术问题，本专利技术提供一种易变山羊草苯丙氨酸解氨酶基因及其应用，进行基因沉默后，抗性鉴定发现降低PAL基因的表达会导致根部禾谷孢囊线虫数目显著增加；构建双元表达载体，将该基因在小麦中过表达，抗性鉴定结果表明PAL过表达小麦对禾谷孢囊线虫的抗性显著提高；且不影响植物营养生长的情况下，降低禾谷孢囊线虫导致的减产。解决以上技术问题的本专利技术中的一种易变山羊草苯丙氨酸解氨酶基因，其特征在于：所述易变山羊草苯丙氨酸解氨酶基因核酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术中易变山羊草苯丙氨酸解氨酶(AeVPAL)基因首次克隆，核酸序列有着独特性，序列具有苯丙氨酸裂解酶结构域，与其它易变山羊草抗虫基因不为同源或近似。本专利技术中一种易变山羊草苯丙氨酸解氨酶基因的应用，为在小麦选育或抗禾谷孢囊线虫中的应用。所述易变山羊草苯丙氨酸解氨酶的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。所述AeVPAL全长编码序列扩增引物序列：PAL-1：ATGGCCACTAATGGCAACGAC；PAL-2：TTAGCAGATAGGCAGGGGCTC；AeVPALVIGS片段扩增引物序列：OHL087:CTAGCTAGCTAGACAACGTGGAAACCTCGGT；OHL088:CTAGCTAGCTAGAGTAAACTGTGCCCAGCTC。本专利技术中AeVPAL核酸序列全长2124bp，序列编码707个氨基酸，蛋白76.3kDa。本专利技术基于近缘物种(大麦、小麦、节节麦)中PAL的编码序列设计引物，以易变山羊草1号材料的cDNA为模板，进行同源克隆，获得全长序列。设计基因沉默引物，将沉默片段连入VIGS(Virus-inducedgenesilencing)载体，进行基因沉默后，抗性鉴定发现降低PAL基因的表达会导致根部禾谷孢囊线虫数目显著增加；构建双元表达载体，将该基因在小麦中过表达，抗性鉴定结果表明AeVPAL过表达小麦对禾谷孢囊线虫的抗性显著提高。本专利技术中易变山羊草苯丙氨酸解氨酶基因编码一个苯丙氨酸解氨酶，其抗禾谷孢囊线虫能力高，对小麦育种以及提高小麦抗禾谷孢囊线虫能力具有重要参考价值。附图说明图1AeVPAL沉默植株根部侵染禾谷孢囊线虫染色情况及统计结果图(其中图中：A为对照植株根部侵染的禾谷孢囊线虫情况图，B为AeVPAL沉默植株根部侵染的禾谷孢囊线虫情况图，C为AeVPAL沉默植株根部中AeVPAL的表达量显著低于对照植株图，D为AeVPAL沉默植株根部中侵染的CCN数目显著多于对照植株图)图2AeVPAL过表达小麦根部侵染禾谷孢囊线虫数目比较图(其中图中：A为转基因小麦Line15、18和对照小麦基因组AeVPAL特异性引物扩增的电泳结果，B为转基因小麦Line15、18和对照小麦中AeVPAL表达量的比较图，C为转基因小麦Line15、18和对照小麦根部侵染禾谷孢囊线虫数目的统计比较图)具体实施方式下面结合具体实施方式对本专利技术进行进一步说明：其中，所用到的材料与试剂如下：植物材料：易变山羊草1号(来源于中科院成都生物研究所实验室)，Fielder小麦(由山东省农科院作物所赠送)。所用引物序列，见下表1。表1试剂：总RNA提取Trizol试剂盒购自TIANGEN公司；DNAMarker、pEASY-T1cloningKit，pEASY-BluntE1ExpressionKit，QPCRmix均为全式金公司产品；KOD高保真酶、反转录kit均为TOYOBO公司产品。体外RNA合成试剂盒购于Promega公司。植物叶片直接PCR试剂盒，为Foregene公司。酸性品红为国药产品。限制性内切酶购于NEB公司。实施例1易变山羊草PAL全长编码序列扩增及植物总RNA提取及反转录：(1)将易变山羊草1号种子浸泡在水中，放置4℃冰箱2天后，再将种子均匀铺陈在持续湿润的滤纸上置于5cm直径的培养皿中，在24℃左右的室温和16h/8h的光照周期环境下发苗。(2)剪取发种后20天的幼苗根，液氮中碾磨，按Trizol试剂方案提取总RNA。(3)参照TOYOBO反转录试剂方法逆转录合成cDNA易变山羊草PAL全长编码序列及沉默片段的扩增：以反转录产物cDNA为模板，使用两对不同的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种易变山羊草苯丙氨酸解氨酶基因，其特征在于：所述易变山羊草苯丙氨酸解氨酶基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种易变山羊草苯丙氨酸解氨酶基因，其特征在于：所述易变山羊草苯丙氨酸解氨酶基因核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.根据权利要求1所述的一种易变山羊草苯丙氨酸解氨酶基因的应用，其特征在于：所述基因在小麦选育中的应用。3.根据权利要求1或2所述的一种易变山羊草苯丙氨酸解氨酶基因的应用，其特征在于：所述基因在抗禾谷孢囊线虫中的应用。4.根据权利要求1所述的一种易变山羊草苯丙氨酸解氨酶基因，其特征在于：所述易变山羊草苯丙氨酸解氨酶氨基...

【专利技术属性】
技术研发人员：张海莉，黄秋兰，龙海，邓光兵，梁俊俊，余懋群，
申请(专利权)人：中国科学院成都生物研究所，
类型：发明
国别省市：四川,51