本发明专利技术公开了一种解淀粉芽孢杆菌GUAL203，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2018870。本发明专利技术还公开了一种解淀粉芽孢杆菌GUAL203在同时防治烟草黑胫病和烟草青枯病中的应用。本发明专利技术解淀粉芽孢杆菌GUAL203具有明显的同时拮抗烟草黑胫病菌和青枯病菌的能力，以及拮抗辣椒炭疽病的能力。
Bacillus amyloliquefaciens GUAL203 and its application
The invention discloses a Bacillus amyloliquefaciens GUAL203, which is stored in a typical culture preservation center in China, and the preservation number is CCTCC NO:M 2018870. The invention also discloses the application of Bacillus amyloliquefaciens GUAL203 in the simultaneous control of tobacco black shank disease and tobacco bacterial wilt. The Bacillus amylolytica GUAL203 of the invention has obvious ability to antagonize tobacco black shank pathogen and bacterial wilt pathogen at the same time, as well as the ability to antagonize Capsicum anthracnose.
【技术实现步骤摘要】
解淀粉芽孢杆菌GUAL203及其应用
本专利技术涉及一种解淀粉芽孢杆菌GUAL203及其应用，属于生物防治
技术介绍
烟草黑胫病和烟草青枯病是我国烟草生产中最具破坏性的土传病害，每年造成巨额经济损失，贵州省是我国烟草生产的主要产区之一，烟草土传病害的发生也尤为严重，每年由病害造成的经济损失将近亿元，严重影响烟农的经济收入。目前生产上该病害的防治主要采取种植抗(耐)病品种及栽培防治为主、药剂防治为辅的综合防治措施，但生产实际中仍未有合适的抗(耐)土传病害的优良品种。因此，目前大多采用化学防治方法控制病害。目前药剂防治依赖甲霜灵、农用链霉素等化学农药，由于可供选择药剂品种少，主用药剂的使用年限长，病原菌的抗药性逐年增加，农药残留及环境污染等负面效应也逐步增加。因此，生物防治近年来已发展成为烟草病害防治研究的热点领域。使用芽孢杆菌进行植物病害的防治是目前生物防治研究的热点领域之一，芽孢杆菌具备了产业化的前提条件，适应性广；作用机制多样，不易产生抗药性；发酵周期短，生产成本低；能形成芽孢、易储运；环境友好，对人畜安全，因此利用芽孢杆菌开发生防制剂成为生防制剂开发的重要方向。对于烟草土传病害(烟草黑胫病和烟草青枯病)生防芽孢杆菌的筛选国内外也有一些学者进行了尝试。此外，贵州地区烟草黑胫病和烟草青枯病常常混合发生，目前还未有文章报道筛选了同时可以防治这两种病害的芽孢杆菌。另外，辣椒炭疽病是辣椒生产上的主要病害之一，在辣椒整个生育期均可为害，造成很大损失。贵州省是我国辣椒的主要栽培地之一，辣椒的长期连作造成炭疽病的发病面积不断扩大，严重影响农民收入。目前生产上主要采用化学农药防治病害，病原菌的抗药性逐年增加，田间用药量也相应增加，极易造成农药残留和环境污染。因此，采用生物防治进行辣椒病害防治是目前研究的热点领域。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是：提供一种解淀粉芽孢杆菌GUAL203，可同时防治烟草黑胫病和烟草青枯病，以及防治辣椒炭疽病，以克服现有技术的不足。本专利技术的技术方案是：一株解淀粉芽孢杆菌GUAL203，该菌种已于2018年12月22日保藏在中国典型培养物保藏中心(地址：中国武汉武汉大学)，保藏编号为CCTCCNO：M2018870，名称为：解淀粉芽孢杆菌GUAL203(BacillusamyloliquefaciensGUAL203)。本专利技术还提供一种解淀粉芽孢杆菌GUAL203在同时防治烟草黑胫病和烟草青枯病中的应用。本专利技术还提供一种解淀粉芽孢杆菌GUAL203在防治烟草黑胫病中的应用。本专利技术还提供一种解淀粉芽孢杆菌GUAL203在防治烟草青枯病中的应用。本专利技术还提供一种解淀粉芽孢杆菌GUAL203在防治辣椒炭疽病中的应用本专利技术的有益效果是：本专利技术从贵州省黔西南州安龙县烟草黑胫病和青枯病发病严重地块采集健康烟株根际土壤，从中筛选分离得到芽孢杆菌GUAL203，具有明显的同时拮抗烟草黑胫病菌(Phytophthoranicotianae)和青枯病菌(Ralatoniasolanacearum)的能力，以及拮抗辣椒炭疽病的能力。通过形态学、生理生化特性及16SrDNA基因鉴定GUAL203为解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)。附图说明图1芽孢杆菌对烟草黑胫病菌的拮抗效果筛选，CK：烟草黑胫病菌(Phytophthoranicotianae)；GUAL203表示筛选到的具有拮抗效果的芽孢杆菌菌株；图2芽孢杆菌对烟草青枯病菌的拮抗效果初筛，CK：烟草青枯病菌(Ralatoniasolanacearum)；GUAL203表示筛选到的具有拮抗效果的芽孢杆菌菌株；图3菌株GUAL20316SrDNA基因进化树；图4菌株GUAL203菌落形态及生物膜(biofilm)形态；图5菌株GUAL203抗菌谱鉴定；图6菌株GUAL203抗菌物质鉴定。具体实施方式下面结合附图及具体的实施例对专利技术进行进一步介绍：一、解淀粉芽孢杆菌GUAL203的分离与筛选1.材料与方法1.1材料土样采集于2017-2018年分别从贵州省黔西南州安龙县烟草黑胫病和青枯病发病地块采集健康烟株根际土样，采用5点取样法，将同一地块土样混合算1份土样。使用纸袋收集土样，土壤采集工具提前消毒，避免土壤微生物混杂。1.2培养基LB培养基用于芽孢杆菌的分离保存和平板对峙实验中；PDA培养基主要用于平板对峙实验中。1.3烟草病害菌株供试菌株烟草黑胫病菌(Phytophthoranicotianae)和烟草青枯病菌(Ralatoniasolanacearum)由贵州大学农学院植物病理学教研室提供。2.根际芽孢杆菌的分离与保存采用稀释平板法，将土壤稀释液在85℃的水浴锅中水浴30min以杀死绝大部分非芽孢细菌。取100μL稀释液涂LB平板，每浓度涂平板3个，37℃下培养。培养1天后，挑取不同的单菌落，进行转管并保存于-80℃冰箱。3.烟草黑胫病菌和青枯病菌拮抗芽孢杆菌筛选以烟草黑胫病菌和青枯病菌作为供试植物病原菌，通过平板对峙法筛选同时可以拮抗两种病原菌的芽孢杆菌，通过初筛和复筛观察是否产生抑菌圈，并利用十字交叉法测量其抑菌直径，再通过特定平板检测是否有生物膜、蛋白酶、纤维素酶、嗜铁素、磷酸酯酶等的产生，选择拮抗效果较好的芽孢杆菌1株，编号为GUAL203(见图1和图2)。抑菌率(％)＝[(对照组菌落直径-处理组菌落直径)/处理组菌落直径]×100二、解淀粉芽孢杆菌GUAL203的鉴定1.生防菌株鉴定通过形态学、生理生化特征及16SrDNA基因对筛选的菌株进行鉴定。1.1菌落形态观察接种菌株至含有5mLLB培养液的试管中，37℃过夜摇培，离心收集菌体，菌体用无菌水清洗3次，最后用无菌水重悬并稀释至浓度1×108CFU/mL，在LB平板上滴加10μL菌液，37℃过夜培养后观察菌落形态。1.2生理生化特征根据《伯杰氏系统细菌学手册》，对菌株的生理生化特性进行测定。1.3分子生物学鉴定50mg/mL溶菌酶37℃水浴1h处理菌体，采用Biomiga细菌基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA。以基因组DNA为模板，采用16SrDNA通用引物27F/1492R进行PCR扩增，PCR产物验证正确后送上海生工进行PCR产物测序。测序结果于NCBI数据库进行BLAST比对分析，并利用CLUSTALX软件进行多序列比对和系统进化分析软件MEGA6中的Neighbor-Joining算法构建系统发育树。经分析：GUAL203可在LB培养基上形成比较复杂的菌落结构(图4)。菌株的生理生化特性见表1，株菌为G+，可分解葡萄糖、鼠李糖和甘露醇，产生过氧化氢酶和硝酸还原酶，甲基红染色阳性，可液化明胶等特征。通过16SrDNA基因序列分析，构建了菌株GUAL203的16SrDNA基因进化树，结果显示，菌株GUAL203与解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)聚到一个分支(图3)。通过形态学、生理生化特性及16SrDNA基因鉴定AL203为解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)。表1菌株GUAL203生理生化特征+：阳性反应；-：阴性反应2.生防菌株抗菌谱鉴定菌株GUAL203具有光谱拮抗活性，对烟草黑胫病菌、本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一株解淀粉芽孢杆菌GUAL203，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2018870。
【技术特征摘要】
1.一株解淀粉芽孢杆菌GUAL203，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2018870。2.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌GUAL203在同时防治烟草黑胫病和烟草青枯病中的应用。3.权利要...
【专利技术属性】
技术研发人员：彭丽娟，丁海霞，余水，
申请(专利权)人：贵州大学，
类型：发明
国别省市：贵州,52
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